すでに、レビュアー１，２の意見の一部を午前中に紹介しました。
午後は、レビュアー３の方の意見と、これら３人のレビュアーの査読文章に対して、自らのノフラーブログで、ノフラー氏自身が意見を書いています。
最初から、アンチSTAP色の強いノフラー氏の意見を紹介します。
学とみ子の印象では、レビュアー１の方は、一番アンチSTAPです。
緑フィルターは死細胞、STAPはES細胞の汚染の可能性と言っていて、最初からSTAPを認めようとしません。査読者としては、著者に対して礼を失しているという印象を持ちます。
レビュアー２は、午前中に紹介しましたが、一番熱心にSTAP論文を評価して意見をくれています。
学とみ子の印象では、決してSTAP細胞を否定しているわけではなく、CD４５細胞の中に多能性の幹細胞が混じっていたのではないかの疑惑を懸念しています。
しかし、STAP細胞すなわち CD４５細胞を酸浴した後に、多能性の細胞が生まれた事実を否定していません。
レフェリー２の査読者とて、キメラを構成した細胞を知っているわけではありませんが、レビュアー１のようなES汚染といった失礼なコメントではありません。
レフェリー２の査読者は、TCRの項目でも、PCRで増幅してはいけないと言っていますし、TCR痕跡のあるT細胞がクローナルな増殖をした場合のキメラ構成と、限定条件をつけています。ここでも、酸浴後に多能性細胞が生まれた可能性を否定しているわけではありません。しかし、著者らのおこなったTCR実験は間違いであると言っています。体細胞をPCRで増幅したら、細胞汚染が起きると言っています。
レビュアー２は、キメラ形成には、TCR痕跡のあるT細胞がクローナルに増えた可能性は考えにくく、もっと多能性の能力の高い細胞が他にあって、キメラを構成したことを考慮せよ！と言うことなのでしょう。
どのタイプの細胞が酸浴後に多能性を持つ細胞に変換し、キメラを構成したのかを、誰も特定できない段階で書かれた論文だからです。
レビュアー２の方のさらなる要求は高いのですが、ここの記述を読むと、幹細胞の培地条件についての質問などが書かれていていて、なぜACTHを入れているのか？栄養源は何なのか？と質問が繰り出されています。
幹細胞に関する実験は若山研究室でのクレジットであること、すなわち、笹井氏の関与していない多くの実験があったことがわかります。
レビュアー２の方自身は、STAP論文内で疑問に思うことが多くあり、いろいろ質問をしているのです。貴重な記録と思いました。
レビュアー３は一番好意的で、基本的にSTAP細胞を認めていると思います。
私がこう書くとES論の日本では、反論が書き込まれるかもしれませんが、少なくとも、学とみ子にはそのように感じるということです。
しかし、ノフラー氏に言わせると、３人すべてのレビュアーは３人共、STAP細胞を全く認めていない！となります。
研究界は、論文完成前から激しい研究者間の抗争があり、それが査読という作業にも、強く反映されているということなのでしょう。
ノフラー氏に言わせると、サイエンス誌でこれだけ反論のあったSTAP論文が、なぜ、ネイチャー編集部はアクセプトしたのか？となってしまうのです。
まず、レビュアー３の査読文を書きます。青字
The finding described in this manuscript is very unusual and unexpected. Under certain circumstances, it appears that a non-physiological non-specific stress can trigger reprogramming of terminally differentiated cells, such that the cells enter a pluripotent stem cell-like state. If these results are repeatable, a paradigm of developmental biology would be changed. Currently, that paradigm is that terminally differentiated states are set and cannot be reset. Although Yamanaka broke this biological rule by overexpressing pluripotency-associated factors, that system is highly artificial. The authors of the present manuscript propose that cells have an intrinsic capacity to reprogram. I found the manuscript to be clearly written and concise, although sometimes mildly unorthodox in terms of literature cited.
However, the methods and cell protocols used must be described in far more detail. For example, the section on Oct4 should state how many cells were sorted and describe the appearance of the cells. Is it possible that rare populations of cells pre-exist or are already apparent on day 1 (thus, what are the “dots” of Fig. 1?). The authors will argue that, indeed, under certain circumstances, they were able to reprogram terminally differentiated cells, and that this was attributable to TCR recombination. I think, ideally, that the cells should be experimentally tagged and traced. This would unequivocally clarify the source of the cells and, further, would exclude the possibility that some cells pre-existed in a pluripotent state.
Critically, it is necessary to determine whether SAC cells can propagate stably in culture and whether such cells can be passaged. CD45.2 cells from the spleen are differentiated and, unless activated by an antigen, are supposed to be in G0. Do these cells re-enter the cell cycle? The cells should be further characterized.
Some negative controls are missing. See Figs. 2A, S3B, S3C, S5A, and S5B. Unstressed cultured cells should be used as negative controls.
In Figs. 3C and D, it would be interesting to see the ATP and ROS levels in both ES and SAC cells.
In Figs. 3C and D, it is apparent that mES cells show rises in ATP and ROS levels, and in mtDNA copy number. These results should be compared to other publications.
In Fig. 2, Nanog is not located in the nucleus. Also, do the authors have data on staining of Oct4 in this experimental context
参考
レビュアー3
この論文原稿に記載されている発見は、今まで想定されてきた事実を超えている。特定の状況下では、非生理学的非特異的ストレスが、末梢分化細胞の再プログラミングを誘発し、細胞が多能性幹細胞様状態に戻る事を示唆する。
これらの結果が再現可能であれば、発達生物学のパラダイムが変わるだろう。
現在の認識では、細胞パラダイムは、最終的に決定された状態が設定され、リセットすることができないことになっている。
山中氏は多能性関連因子を過剰発現させることによってこの生物学的ルールを破ったが、これは高度に人工的な改変条件を加えたからである。
この原稿の著者は、細胞が再プログラムできる本来的能力を保有すると言っている。この事実が、論文原稿に明確かつ簡潔に書かれている。
しかしながら、使用される方法および細胞プロトコールは、より詳細に記載されなければならない。
たとえば、Oct4は、ソートされたセルの数を記述し、セルの外観を記述する必要がある。細胞のまれな集団が1日目からすでに存在するのか、その可能性はあるのか？（したがって、図1の「ドット」は何か？）
著者らは、特定の状況下では、最終分化細胞を再プログラムすることができると述べ、TCR組換からもそれを示唆すると主張する。
理想的には、細胞は実験的にタグ付けされ、追跡されるべきだと私は思う。
そうすることで、細胞の供給源を明らかにし、さらに、多能性状態の細胞が予め存在する可能性を排除できる。
重要なことに、SAC細胞が培養中で安定して増殖することができるかどうか、およびそのような細胞が継代され得るか否かが大事である。
脾臓由来のCD45.2細胞は分化しており、抗原によって活性化されない限り、G0にあると考えられる。これらの細胞は細胞周期に再び入るのか？その細胞現象をさらに特徴付けるべきである。
いくつかのネガティブコントロールが欠けている。
図を参照してください。 2A、S3B、S3C、S5A、S5Bを含む。ストレスのない培養細胞をネガティブコントロールとして使用すべきである。
また、図3CおよびDに示すように、ESおよびSAC細胞の両方においてATPレベルおよびROSレベルを見ることは興味深い。
また、図3CおよびDに示すように、mES細胞はATPおよびROSレベルの上昇およびmtDNAコピー数の上昇を示すことは明らかである。これらの結果は、既出論文と比較されるべきである。
図2において、Nanogは核内に位置していない。また、著者らは、この実験
においてOct4の染色データを有している。
サイエンス誌における、この3人の査読者のレビューについて、ノフラー氏は、ノフラーブログで以下のように書いています。茶字
As a result of reading the Science reviews, today we know what the reviewers at Science thought in 2012 of this proto-STAP paper and this sheds much light on what went so terribly wrong with STAP overall. There were many big red flags. Keep in mind that the Nature reviewers would not know about the Science reviews unless by chance one or more of the reviewers for Nature had also participated in the review process at Science.
This early generation STAP paper was entitled “Stress altered somatic cells capable of forming an embryo”.
There was no “STAP” acronym at that point. Instead, the stress-produced stem cells were called “SACs”, an acronym presumably standing for “stress-activated somatic cells” or “stress-altered stem cells”. Therefore, let’s call this proto-STAP paper, the SAC paper.
All three Science reviewers had serious doubts about the SAC paper and pointed out numerous specific concerns.
For example, Reviewer 1 right away early in their review pointed out that the SAC phenomenon was probably not real and was instead explainable by two simple experimental problems: stress-associated GFP reporter activation and cell culture cross contamination.
Crucially, this same reviewer noticed the gel splice, later present in the accepted Nature STAP article Figure 1. However, apparently the STAP/SAC team did not take that concern or most of the other reviewer issues to heart.
Reviewer 2 was extremely skeptical of SAC as well, listing twenty-one specific problems/issues to be addressed. Unfortunately, it seems that most of these concerns also remained unaddressed in the later accepted Nature STAP papers. It is fair to say that although 21 issues seems like a lot that these concerns seem reasonable and not overly harsh.
What else did the reviewers say?
Both Reviewers 1 and 2 had the shared concern that pluripotency-related gene expression seemed abnormally high in the SAC cells. Way way too high.
Reviewer 2 wanted much more data before being convinced. For example, they wrote:
Given the novelty of the claims, a thorough characterization of the SACs is warranted, as is some probing of the mechanisms. This would necessitate a more sophisticated genomic analysis of SACs, through microarray or RNA-seq, and genome-wide DNA methylation analysis — analyses that other pluripotent stem cell lines have been routinely subjected to and for which methods for smaller cell numbers have been developed.
Reviewer 3 was not as detailed with their concerns, but more generally identified some areas of concern such as those articulated in this paragraph:
the methods and cell protocols used must be described in far more detail. For example, the section on Oct4 should state how many cells were sorted and describe the appearance of the cells. Is it possible that rare populations of cells pre-exist or are already apparent on day 1 (thus, what are the “dots” of Fig. 1?). The authors will argue that, indeed, under certain circumstances, they were able to reprogram terminally differentiated cells, and that this was attributable to TCR recombination. I think, ideally, that the cells should be experimentally tagged and traced. This would unequivocally clarify the source of the cells and, further, would exclude the possibility that some cells pre-existed in a pluripotent state.
Critically, it is necessary to determine whether SAC cells can propagate stably in culture and whether such cells can be passaged.
参考
2012年にサイエンスの査読者が、このproto-STAPの論文をどのように評価したかを、私（ノフラー氏）は知ることができ、STAPの全体像の間違いが明らかになりました。
大きな赤い旗がたくさん立ったのです。
Natureの査読者の一人以上がScienceの査読にも参加していなければ、Nature査読者は、Scienceにおける査読経緯を知ることができませんでした。
この初期の頃のSTAP論文原稿は、「胚を形成することができるストレス変化した体細胞」と題されたものです。
その時点では "STAP"頭文字はありませんでした。代わりに、ストレスによって産生された幹細胞は、「ストレス活性化体細胞」または「ストレス改変幹細胞」の略である「SAC」と呼ばれました。したがって、このproto-STAP論文、SAC論文と呼ぶことにしましょう。
3人の査読者はすべてSAC論文に深刻な疑念を持ち、多くの具体的な懸念を指摘しています。
例えば、レビューアー1は、レビューの早い段階でSAC現象がおそらく実際ではなく、代わりにストレス関連GFPレポーター活性化と細胞培養汚染の2つの単純な実験的問題によって説明できると指摘しました。
しかし、STAP / SACチームは、査読者が指摘した問題をほとんど、心に留めていませんでした。
レビューア2は、SACについて非常に懐疑的であり、取り組むべき21の具体的な問題/課題を列挙しています。残念なことに、これらの懸案事項の大部分は、後に受け入れられたNature STAPの論文でも扱われていないようです。 21の問題は多くのように思えますが、これらの懸念は過度に過酷ではないと思われます。
レビューア1および2の両者は、多能性関連遺伝子発現がSAC細胞において異常に高いとの共通の懸念を表していました。
レビュアー2は、論文を確かなものとするには、はるかにさらなる多くのデータを必要とするとしていました。たとえば、彼らは次のように書いています。
・・・
レビュアー3は、懸念事項について詳しくは述べられていませんでしたが、この段落で明記されているSTAP論文の問題点を特定しました。
参考訳として示した日本語は、機械翻訳を併用しています。疑問に思う方、参考訳の間違いを指摘したいと思う方は、ご自身の信じる考え方や実際の訳をお示しください。
コメント（127）
キメラ組織（T細胞以外）でTCR再構成が検出されれば、T細胞が初期化された絶対的な証明になるので、Natureレベルの査読では要求されるでしょう。CD45ソートでは、純度を100%にできないので、初期化の絶対的な証明になりません。造血細胞由来である事を強く示唆する所見とは言えますけどね。T細胞だけを取り出して酸処理すれば、キメラでTCR再構成が検出できる確率が高まると考えられ、サイエンスの査読後にトライすべきだったと思います。
ES細胞の混入は、細胞特異的なゲノム欠失を検出する事によって示されており、ゲルの切り貼りはES混入とは無関係と考えます。貼られたのは、ソートしたT細胞のTCR再構成を示す、いわゆる「ポジコン」であり、ES細胞とは結びつきません。もともとT細胞を含む脾臓細胞を処理しているので、STAP細胞プレップでTCR再構成が検出されても不思議はなく、これらの細胞が多能性を持つ事を、できれば体内（キメラ）で証明する事が重要です。
STAPキメラが何の細胞からできたのかわかっていません。
T細胞は可能性のひとつにすぎません。＝＝＝中略＝＝＝
そして、サイエンスに投稿した時に、査読者のNo2氏にこの尻尾細胞実験のミスを指摘されました。
その結果、笹井丹羽参加後の論文バージョンでは、この尻尾図を除いています。
＝＝引用ここまで＝＝
ごちゃごちゃ書いてありますが中身はただのカオスですね。
TCR再構成でリプログラミングの証明にするという実験が、成功率の当初見込みが甘かったというだけの話。実験のデザインを見直すべきだったということ。
成功と胸をはれるだけの結果ではないのに、成功したかのような記述をしたから不正を疑われたんですね。調査報告書を読めば明記されていますが、プロトコルエクスチェンジで訂正をしなければ「悪質な隠蔽」とされた可能性があったということです。
これはES混入が故意であるという疑惑を補強しましたが、あくまで補強にすぎません。直接の因果関係がないので証拠にはなりえません。
狸さんのブログの最新記事、良く読んでくださいね。
やはり、NHKスペシャルの説明は科学的には正しいことを述べており、それを学さんは間違って理解したことが良く判りました。
上のＬさんのコメントも、ある意味、私と同じことを書かれていますが、、、 学さんでは理解できないかもしれませんね。
ところで、
>（１）TCR痕跡がなければ、STAP細胞は元のCD45からつくられたのではない！
というのは明らかにおかしな発言だと思いますが、
それは誰が言っているのでしょうか。
学とみ子さんは非常にしばしば、他人の発言を誤って記憶するようですので、これは誰の発言で、どこで見ることができるのか明らかにしていただけませんか？
狸さん（ttp://giveme5.hateblo.jp/entry/2018/06/05/131802）がNHKの番組のナレーションを文書化したページ（ttp://sci.tea-nifty.com/blog/2014/07/nhk-727-18f7.html）を見つけられて、NHKの番組では「TCRという細胞が追跡の鍵となる。TCR再構成が見つかれば証拠になるが、それは調べた、という1文しか論文にない。証明が十分できていなかったのではないか。」だけのようです。つまり学さんの（２）が必要とNHKは言っているのであって、「（１）にすり替えた」とは、誰がすり替えたのかを示さない限り、学さんの作った藁人形のようですね。STAP幹細胞がES細胞によるフェイクであったというのはTCR再構成の有無とは直接関係ないです。
狸さんが実験の解説を求めていますよ。
＞「（１） にすり替えた」とは、誰がすり替え たのかを示さない限り、
やっぱりさんとの議論で、すり替えたとかんじました、｡その議論の記録がのこっています、５月１６日のタイトル「この事実は…」のコメントの真ん中あたりですね｡
探すのは大変と思うので、そのうち、記事に取り上げるかもしれないです。
やっぱりさんは、私を否定知るためにこちらにくるので、状況に応じて（1）（2）を巧みにすり替えます｡
相手してるときりないです｡
>T細胞だけを取り出して酸処理すれば、キメラでTCR再構成が検出できる確率が高まると考えられ、サイエンスの査読後にトライすべきだったと思います。
サイエンスの査読者２も、分化T細胞をモノクローナルに増殖させたらどうか？とか、あるいは、T細胞に限らず、STAP細胞すべてに共通の痕跡を助言しています。
分化T細胞は、次のマウスの中で生き残れるかは、不明です。ホストの胚の免疫状態とか、STAP細胞側のインタクトなTCR遺伝子発現状況も未知です。私の推論では、増殖は無理だろうと思います。つまり、キメラは発生しないであろうと・・・。
しかし、ここは新規実験ですから、答えはまだありません。
こうしたいろいろな疑問について、小保方氏は若山氏に聞ける状況は無かったのではないでしょうか？
＞＞「（１） にすり替えた」とは、誰がすり替え たのかを示さない限り、
＞やっぱりさんとの議論で、すり替えたとかんじました、｡その議論の記録がのこっています、５月１６日のタイトル「この事実は…」のコメントの真ん中あたりですね｡
おやおや、もう学さんの記憶って、滅茶苦茶なんですね。
学さんが勝手に、私の意見を（１）ですね、と誤解してきたので、
そのことを明確に否定したのに、、
大丈夫ですか？
2018/5/21(月) 午後 8:33 学とみ子
キメラやテラトーマは、遺伝子欠損した細胞で構成されていなければ、STAPから作られたと言えないとの主張ですね
2018/5/21(月) 午後 8:43[ yap*ari*w*katt*na* ]
> 学とみ子さん
人の意見を勝手に捻じ曲げるのはやめてほしいですね。
私の意見は本日午後0:54のコメントの通りです。下記に再掲します。貴方の捻じ曲げとの違いが分かりますか？
そもそも、STAP細胞なるものが、MUSE細胞のように元々存在していてセレクションされたものではなく、酸性刺激によって分化した体細胞が初期化したものである、ということを示すために、TCR再構成が起こったＴ細胞を材料としてSTAP細胞を作成して、そこにはTCR再構成を示すバンドがある、というのが、例の改ざん研究不正とされたFIG.1iの電気泳動の画像だったわけですが、、
すでに査読の段階で、STAP細胞が初期化された細胞だというなら、STAP細胞由来のテラトーマやキメラマウスにもTCR再構成を確認すべきとい
学さんの（１）（２）は、科学的には少し不正確な記述ですが、まあ、大意はかわらないので、そのまま使わせていただきますが、、
すなわち、私は最初から（２）であることを説明しているのに、勝手に学さんが脳内変換で捻じ曲げて、「貴方の意見は（１）なんですね」と聞いてきたので、 「どこをどう読んだら（１）になるのか理解できない、私は最初から（２）だと言っている」という回答をしていた訳ですよ。
にもかかわらず、その説明が理解できないのか、さらに脳内変換で捻じ曲げたのか判りませんが、私の主張が（１）から（２）にすり替えたように感じた、という、寝ぼけたことを学さんが書いているのです。
理解できませんか？？？
改めて、指摘しておきます。
私のコメントについて、勝手に学さんが捻じ曲げておいて、私が意見をすり替えたなどと非難して騒ぎ出す。
NHKスペシャルの説明についても、科学的に正しいことを述べているのに、学さんが勝手に脳内変換で捻じ曲げて、この学者は間違っているとか騒ぎだす。
ES混入についても、混入の対象はキメラやテラトーマだというものなのに、学さんが勝手に脳内変換して「STAPとESの比較実験はES混入では説明できないのでES説は破たんしている」などと、気が狂ったような説を持ち出して騒ぎ出す。
こんなのばっかりですよ。
他人の意見や報告書の内容を、もう少しまともに理解してくださいね。
＞（１）から（２）にすり替えたよ うに感じた
私がかんじたのだからそれでいいでしょう…
すり替えてなければ、私には好都合です。
私はあなたは何でも知っていると買いかぶっていました｡
ホントに知らないのですね｡
その程度で、よくこれほど見ず知らずの人に悪口書けますね｡
あなた自らは研究者でないと逃げ道を用意していて…、
今後、悪口一覧表に載らないように、文章に気をつけてくださいね、｡
＞私がかんじたのだからそれでいいでしょう…
それでいいという問題ではありませんよ。
（１）は、誰も主張していない、学さんが脳内で作り上げた藁人形ということを認めたわけですね。
そして記事本文では、こうも書いていますね。
＞NHKに間違いを吹き込んだ学者の考えは（１）です。
これまた、狸さんが元のNHKスペシャルで行われた説明を掘り起こしてくれたおかげで、学さんの間違った妄想の産物であることが確認できました。
このように誰も主張していない（１）を、私やNHK番組に関わった学者の考えのように捻じ曲げて伝え、（１）は間違っている、こいつらは生物学を何も理解していない、と誹謗中傷しているのですよ。
ここにハッキリと、学さんに対して、訂正と謝罪を要求させていただきます。
モノクローナルなT細胞からSTAP細胞を作る必要はないです。ポリクローナルなT細胞由来の細胞塊を注入した場合でも、何らかの多能性を持っている細胞が複数含まれていれば、キメラで複数の再構成バンドが検出できるはずです。キメラ体内で淘汰される可能性や、ホスト由来のT細胞のコンタミの可能性を考慮すると、胎生１０日くらいの胎児で解析するとよいと思います。DJ2だけでなくDJ1の再構成も調べれば、さらに検出確率が上がるはずです。それでもTCR再構成がキメラで検出できなければ、T細胞以外の造血細胞がSTAPの起源として想定されますので、さらなる実験でそこを詰めるのが、正しい研究のプロセスだったと思います。
分化T細胞を胚盤胞に注入しても、生き残れないと思いますが、初期化されていれば、生き残ってキメラに寄与する可能性があります（STAP論文の趣旨は、そういう事ですよね？）。逆に、T細胞由来STAP細胞がキメラ体内で生存増幅できないのであれば、体内での多能性はないと判断され、T細胞以外の造血細胞がSTAPの起源と考えるべきです。その場合は、然るべく論文に記載されるべきですよね。
横から失礼します。
Ｔ細胞の寿命の話ですが、これらはあくまで「細胞膜上にタンパクとしてTCRを発現しているＴ細胞」の話ですよね。
そのＴ細胞を「初期化」して得られた多能性細胞である「STAP細胞」においても、Ｔ細胞の寿命の話が適用できると思われますか？
「Ｔ細胞から得られたSTAP細胞」からキメラマウスを作成する際に、「Ｔ細胞」の寿命（アポトーシス）の話は、全く無関係だと思うのですが。
＞サイエンスの査読者２が少し誤解しているのは、細胞塊で注入しているのに、キメラに寄与する細胞は１細胞だけ（モノクローナル）と決めてかかっている事です。仮に１細胞あっても、TCRアレルは二つあるので、再構成バンドが二本あってもおかしくないし、複数のT細胞由来細胞がキメラに寄与すれば、さらにバンドが増える可能性があります。
大事な情報をありがとうございました。
初期化された場合は、別の話になるだろう事は、寿命の話の前のコメントに書きました。yap*ari*w*katt*na*さんと同じ考えだと思います。
学さんとの間で、話が噛み合わないようなので、少し違う視点で議論しようと思い、T細胞の寿命の話をして見ました。幹細胞も面白いですが、免疫も面白いですよ。
＞学さんとの間で、話が噛み合わないようなので、少し違う視点で議論しようと思い、T細胞の寿命の話をして見ました。
Ｌさん、その話をする前に、明確に学さんが間違っている部分を指摘してあげてくださいよ。 私の説明は聞こうともしないのでね。
Ｔ細胞の寿命は、非常に複雑な調整をされているらしいことは少し調べて見つけましたが、、 結局は 「細胞膜上にタンパクとして発現してるTCRを介してのアポトーシス」のようですね。
そうなると、Ｔ細胞の性能とか寿命と言う議論は、タンパクとしてTCRを発現していない細胞には当てはめられない、すなわち学さんの主張する「Ｔ細胞由来のSTAP細胞」にはＴ細胞の寿命の話には当てはめられない、ということなんですが、、
ここに関するＬさんの見解を明確にしていただけませんか？
（即ち、TCR再構成のあるキメラマウスができるかという疑問に対して、Ｔ細胞の寿命の話を当てはめるのは学さんはナンセンスだと）
ため息さんが、かなり説明してくれてますが、理解してもらえないようです。私が同じ筋で説明しても理解してもらえないと思うので、変化球を投げてます。ご理解下さい。