４．低濃度長期ホルムアルデヒド及びトルエン曝露の免疫系、及び神経―免疫軸への影響についての検討
研究協力者 藤巻秀和、黒河佳香、山元昭二、掛山正心（独立行政法人国立環境研究所）欅田尚樹（産業医科大学）
（１）研究目的
MCSの発症と低濃度化学物質曝露との関連について検索するためには、アレルギー反応とは異なる過敏状態の誘導の有無について調べることは大変重要である。
MCS患者の中にはアレルギー疾患の既往歴のある人が60%近く含まれるという報告もみられているので、MCSの発症と免疫系との何らかの関連性が推測された。
化学物質の曝露による過敏状態とアレルギー性炎症モデルでの反応指標（IgE抗体産生、Th2タイプの優位性、肥満細胞活性化等）との違いについて明らかにするために、ホルムアルデヒドのみの曝露群と抗原を腹腔内投与とエアロゾルで感作しながらホルムアルデヒドを曝露したアレルギーモデル群における免疫応答を比較検討した。
また、神経―免疫軸における反応のかく乱がMCSの発症に関わることが示唆されていたので、神経栄養因子や神経伝達物質レベルでの変動についても検討した。
（２）研究方法
すでにこれまでの報告書に詳述してあるので、省略。
（３）主な研究結果
3-1 肺における炎症性反応の解析
肺における炎症反応の指標として考えられる肺胞洗浄液における炎症性細胞の集積とその中のサイトカイン･ケモカイン産生についてホルムアルデヒド曝露について調べた結果、ホルムアルデヒド曝露のみ（抗原無群）では肺胞洗浄液中の炎症性細胞数やproinflammatory サイトカインレベルで変動はみられなかった。
しかしながら、アレルギーモデル群の2000ppb曝露群では有意な炎症性細胞の増加が見られた。
集積した炎症性細胞の分類では肺胞マクロファージと好酸球の数の有意な増加がみられた。
次ぎに、肺胞洗浄液中の炎症性サイトカイン産生について、アレルギーモデルマウスの
IL-1β産生は濃度依存的な低下を示し2000ppb 曝露群で有意に低下した。IL-6 とTNFα産生でも同様に低下の傾向がみられたが、統計学的には差はなかった。
炎症性細胞の集積や活性化に関与するケモカイン産生では、MIP-1αとMCP-1 産生においては抗原の感作の有無に関係なくホルムアルデヒド曝露群と対照群との間に有意な差はみられなかった。
トルエン曝露の結果では、トルエン曝露のみで肺胞洗浄液中の総細胞数とマクロファージ数は有意に増加したが、好中球とリンパ球などでは差はみられなかった。
アレルギーモデルマウスにトルエン曝露を行うと、肺胞洗浄液中での炎症性細胞の集積においては、トルエン曝露による有意な増加は認められなかった。
トルエン曝露のみでは肺胞洗浄液中のIFN-γ産生量の有意な低下がみられたが、TNF-αでは差はみられなかった。
3-3 血中抗体価の変動解析
全身の免疫系への影響指標としての血漿中の抗原特異的抗体価と総抗体価をELISA 法によって測定した結果では、総IgE 抗体価においてホルムアルデヒド曝露のみの群では増加傾向がみられたが、抗原感作群へのホルムアルデヒド曝露では有意な差はみられなかった。
抗原
特異的IgE 抗体価、IgG1 抗体価、IgG2a 抗体価においては再現性のある有意な差は認めなかった。
トルエン曝露したマウス血漿中のOVA 特異的な抗体価を測定すると、抗OVA IgG2a で有意な増加がみられたが、IgE,IgG1 レベルでは差はみられなかった。
血漿中の総抗体価においては、トルエン曝露によるIgE 抗体価で有意な増加がみられた。
3-4 脳内サイトカインと神経栄養因子の変動
脳における炎症性サイトカイン等の産生への影響を調べるために、ホルモン分泌の調節機能をもつ下垂体、記憶にかかわる海馬､情報の受け取りに重要な線条体を取り出しそれぞれの領域における産生量を測定した。
ホルムアルデヒドのみの曝露、あるいは抗原感作とホルムアルデヒド曝露によるそれぞれの領域での産生において、IL-6、TNFα、IL-1β,IL-12p40,TGFβ
のいずれにおいても曝露群と対照群との間に有意な差はみられなかった。
脳における神経栄養因子産生への影響を調べるために下垂体、海馬､ 線条体の組織でのNGF 産生についてホルムアルデヒドのみの曝露、あるいはアレルギーモデルにホルムアルデヒド曝露したマウスで検討した。
その結果、抗原吸入感作しホルムアルデヒド曝露したマウスの海馬において400ppb で有意な増加を認めた。
下垂体と線条体では海馬と比べると低い産生量を示し曝露群とコントロール群との間に変化はみられなかった。
ホルムアルデヒド曝露のみのマウスでは、下垂体や線条体と同様海馬においても差はみられなかった。
NGF と同様な働きをもつBDNF の産生量についても下垂体、海馬､線条体で検討した。
BDNF 産生量はホルムアルデヒドのみを曝露したマウス、あるいは抗原感作とホルムアルデヒド曝露したマウスでも下垂体と線条体での産生量は非常に低く、また海馬においても曝露群と対照群とで差はみられなかった。
そこで、低濃度ホルムアルデヒド曝露と抗原感作による海馬でのNGFmRNA について検討した。
蛋白レベルの結果と同様に、対照群と比べて、80 と400 ppb 曝露群での顕著な発現増強が見られた。
2000 ppb では対照群と同程度の発現であった。
海馬を含む前額断切片についてNGF の免疫組織化学的検討を行った。
対照群の海馬ではCA1領域からCA3 領域にかけて、また歯状回の細胞においてNGF 陽性反応が認められた。
この発現パターンは、神経細胞を特異的に染色するニッスル染色の発現パターンと酷似していることから、NGF の発現は神経細胞に特に強く見られることが確認された。
一方400 ppb 曝露-OVA(+)群では、対照群と比較して明らかなNGF 発現増強が認められた。
3-5 神経―免疫軸での神経伝達物質受容体解析
RT-PCR による半定量では、海馬と扁桃体で比較した。
ドーパミン受容体D1 受容体mRNAは、トルエン曝露により有意な上昇がみられた。
D2 受容体mRNA は、ホルムアルデヒド曝露により対照群と比較して有意な上昇が認められた。
NMDA 型グルタミン酸受容体サブユニットε1mRNA は、OVA 刺激による有意な上昇がみられ、ホルムアルデヒド曝露により発現が上昇し、すなわちOVA 刺激とホルムアルデヒド曝露の相加効果が見られた。
ε2mRNA は、ホルムアルデヒド曝露では有意な低下がみられたのに対し、アレルギーモデルでは顕著に上昇した。
扁桃体では、アレルギーモデルマウスへのホルムアルデヒド曝露でε1、ε2 の増加、D1の増加が認められた。
D2 にはの変化は認められなかった。
C3H マウスの海馬を含む前額断切片についてNMDAR2A の免疫組織化学的検討を行った。
400 ppb ホルムアルデヒド曝露したアレルギーモデルマウス海馬のNMDAR2A は、対照群に比べて強く発現する傾向が認められた。
runより：これで大体半分くらい掲載しました。
非常に難解で今は私もあまりよく分かっていません。
脳の状態が良い時に読みかえすのでPDFファイルは持っています。