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多段式加圧法を開発した。この方法により製造したクマイザサの抽出物は、従来の熱水抽出法より
はるかに高い活性成分を含んでいる[5]。この延長線上の本研究では、我々は クマイザサ、メシマ
コブ、チャーガの夫々の循環多段式加圧下での抽出物の混合物（メシママックス）を用い、化学誘
発自然発がんモデルを含む各種固型腫瘍モデルにおいてその発がん予防、治療作用を検討した。
また、その作用メカニズムについて、自然免疫の増強を中心に検討を行った。さらに、メシママック
スを我々の開発した抗がん性ナノメディシン（P-THP[Emapraider○R]）の静脈内投与と同時に、
経口投与により併用投与した場合の有用性についても検討した。
2. 材料と方法
2.1. 材料
デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)は MP Biomedicals 社（Irvine, CA）より購入した。 ラテ
ックス粒子-ウサギ IgG-FITC 結合物は Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)より購入した。 チアゾ
リルブルーテトラゾリウムブロミド (MTT) は シグマ社（St. Louis, Mo）より購入した。アゾキシ
メタン (AOM), 7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン (DMBA)、細胞培養用各種培地 (RPMI-1640,
DMEM, DMEM: F12) は 富士フイルム和光純薬株式会社（大阪）より購入した。メシママックス
は コスモバイオス製のもので、株式会社アクシスアン（東京）より提供された。抗がん性ナノメデ
ィシン（P-THP）（ヒドロキシプロピルメタアクリルアミド [HPMA]ポリマー 結合ピラルビシン
[THP]）は本研究室で以前報告した方法により合成した [13]。
2.2. 動物
ddY マウス (雄、６週令)、 ICR マウス (雄、５週令) および SD ラット (雌、６週令) は
SLC (静岡)より購入した。動物は、22 ± 1℃、相対湿度 55 ± 5％に維持した環境で、1 ケージ 4～
5 匹で飼育した。飼育室の照明は 12 時間の明/暗サイクルで設定した。すべての動物実験は崇城大
学動物実験倫理委員会の承認の上、崇城大学動物取り扱い実験プロトコ-ルに従って行った。
2.3. 細胞培養
マウスマクロファージ RAW264.7 細胞は ATCC より購入した。ヒト卵巣がん A2780 細胞は
鹿児島大学医学部の小林裕明教授より分譲された。ヒト子宮頸がん由来 HeLa 細胞は理研セルバン
ク（筑波）より購入した。マウス肝細胞（AML12） は安徽医科大学公衆衛生学部毒理学研究室の張
博士より分譲された。 マウス腎臓上皮細胞(CCL-81) と酵母細胞 (Saccharomyces cerevisiae)は崇
城大学薬学部微生物学研究室の横溝教授より分譲された。RAW264.7 細胞は 10% ウシ胎児血清
(FBS)を含む DMEM (high glucose)培地で、 CCL-81 と A2780 細胞は 10% ウシ胎児血清 (FBS)
を含む RPMI-1640 培地で、HeLa 細胞は 10% ウシ胎児血清 (FBS)を含む DMEM 培地で、AML12
細胞は 10% ウシ胎児血清(FBS)、10 µg/ml のインスリン、5.5 µg/ml のトランスフェリン、5 ng/ml
の亜セレン酸ナトリウムと 40 ng/ml のデキサメタゾンを含む DMEM/F12 で、37℃と 5% CO2、
95％空気の環境で培養された。
2.4. メシママックスの抗腫瘍効果の検討
下記の様々な固型腫瘍モデルでメシママックスの腫瘍増殖及び発がん剤投与による発がんに
対する効果を調べた。
(1) AOM/DSS 誘発マウス大腸がんモデルは ICR マウスに AOM (10 mg/kg)を腹腔内注射し、1 週
間後に 2% の DSS を飲料水に添加して、1 週間マウスに連日投与することにより作成した。メシ
ママックス治療群においては各濃度のメシママックス (0.03%, 0.1%, 0.3%) を AOM の投与日よ
り全実験期間中に、マウスの飲料水に添加して飲ませた。ただし、DSS を投与する間の 1 週間は、
メシママックス をマウスの餌に混ぜて投与した。DSS の投与から 12 週間後に、マウスを屠殺し、
大腸を摘出し、その大腸に生じた腫瘍ノジュールの数を数え、また、各腫瘍ノジュールのサイズ（直
径）を測定し、個々のマウスごとの腫瘍ノジュールのサイズを積算した。
(2) DMBA 誘発ラット乳がんモデルは、DMBA (10mg/ml/ラット、コーンオイルに溶かしたもの)
を SD ラットに経口投与することにより作成した。メシママックス治療群においては、各濃度のメ
シママックス (0.03%, 0.1%, 0.3%) を DMBA の投与日より全実験期間中、ラットの飲料水に添加
して飲ませた。実験期間中は定期的に乳がんの発生状況を確認し、発生した乳がんの腫瘍ノジュー
ルの数と各腫瘍のサイズ（直径）を測定した。
(3) マウス肉腫 S180 を皮下移植した実験モデルは、S180 細胞 (2 106 個/ 100ul) を ddY マウス
の背部皮下に注射することにより作成した。I 群：メシママックスの治療評価群として、腫瘍サイ
ズが 6-8mm 以上に成長したマウスに対して、各濃度のメシママックス (0.03%, 0.1%, 0.3%) を飲
料水に添加し、飲ませた。さらに、II 群： メシママックスの発がん予防の評価のための群の実験
として、メシママックスの投与は S180 腫瘍の細胞移植日と同日よりメシママックス○Rを経口によ
り毎日投与した。次に第 III 群では、今回の重要な実験として、メシママックスと抗がん剤（ナノ
メディシン、P-THP と略）の併用投与における治療効果の増強の評価を行った。即ち、S180 細胞
を移植し、１週間後に移植した腫瘍の直径が 6-8 mm になった時点で P-THP を一回静脈内に注射
し、同時に 0.1% のメシママックス を全期間を通じ、マウスの飲料水に加えた。実験期間中、定
期的に腫瘍のサイズ（直径）を測定した。
2.5. 細胞毒性試験
細胞毒性は MTT アッセイ法により、ヒトがん細胞 (A2780, HeLa) および正常細胞(マウス腎
上皮細胞 CCL-81, マウス肝細胞 AML12) に対するメシママックスのみの細胞毒性を調べた。各
細胞(3000 細胞/穴)を 96 穴プレートに撒き、一晩培養した後、各濃度のメシママックス を細胞に
添加し、さらに 48 時間培養した。その後、培養上清を捨て MTT 試薬（最終濃度 0.56 mg/ml ）を
添加した。さらに 4 時間培養し、培養上清を捨て、各ウェルに 150 µl の DMSO を添加細胞内に
生じたフォルマザン色素を溶解し、570 nm の吸光度により、メシママックス未処理のコントロー
ル細胞群と比較し、メシママックス処理後の細胞の生存率を計算した。
2.6. メシママックスのマクロファージ貪食能への影響
メシママックスのマクロファージ貪食能への影響についてマウスマクロファージ RAW264.7
細胞を用いて検討した。RAW-264 細胞を (1 105/1.5 ml) 6 穴プレートに撒き、一晩培養した後、
各濃度のメシママックスを細胞に添加し 24 時間培養した。その後、ビール酵母 (3 105 個) を添
加し、経時的に顕微鏡下(BZ-X700, 株式会社キーエンス、大阪)で マクロファージ中の貪食された
酵母を観察した。200 個マクロファージにおける貪食酵母数をカウントし、下記の式によりマクロ
ファージの貪食能を計算した。貪食能 = A / 200 100%（A: 酵母を１個以上、貪食したマクロフ
ァージの数）。
別の実験で、蛍光標識したナノ粒子(ラテックス粒子-ウサギ IgG-FITC 結合物) を酵母の代わ
りに用い、同様の実験を行った。マクロファージに貪食されたナノ粒子はフローサイトメトリー
(Accuri ™ C6 Plus, BD, Franklin Lakes, New Jersey)により定量した。
2.7. 統計処理
全てのデータは平均値 ± 標準偏差で表記している。分散分析（ANOVA）とボンフェローニ多
重比較テストによりデータの統計解析を行った。P 値が< 0.05 の時に統計学的有意差があると認め
た。
3. 結果
3.1. 発がんと腫瘍増殖に対するメシママックス の抑制作用
3.1.1. AOM/DSS 誘発マウス大腸がんモデル:発がんに対するメシママックスの作用：がん予防作用
まず、我々はメシママックスの抗腫瘍作用を AOM/DSS 誘発マウス大腸がんモデルを用い検
討した。このモデルにおいて、AOM/DSS の処理により全てのマウスの大腸に複数の腫瘍が発生し
た (Fig. 1a)。 メシママックスの投与により濃度依存的に発生した腫瘍の数が有意に抑えられた
(図 1a)。また、各マウスの大腸に発生した腫瘍の累積体積が顕著に減少した(図 1b).
図 1. AOM/DSS 誘発マウス大腸がんモデルにおけるメシママックスの発がん抑制作用 (a) 大腸
に発生した腫瘍の平均数; (b) 各マウスの腫瘍の累積体積。* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001 vs
Control. データは 平均値 ± 標準偏差で表す, 個数 = 6-8。
3.1.2. DMBA 誘発ラット乳がんモデルにおけるメシママックスの作用：がん予防作用
次に、もう一つのよく使われている乳がんの化学発がんモデルである DMBA の投与により誘
発されるラット乳がんモデルを用いて、メシママックスの抗腫瘍作用を検討した。このモデルにお
いては、DMBA 投与後 10 週目から乳がんの発生が見られ、約 20 週後に全てのラットに乳がんの発
生が認められた(表 1)。この実験系において、メシママックスの投与により乳がんの発生が著明に
遅延されたことがわかった。即ち、メシママックス投与群では DMBA 投与後 15 週までに腫瘍の
発生が全く見られなかった (表 1)。 未治療のコントロール群の全てのラットに乳がんの発生が見
られた時点でメシママックス群における乳がんの発生率は 60% であった(表 1)。つまり、40％の
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