HIFU論文紹介4: 脂肪新生の促進

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美容皮膚科ペルラクリニック神宮前院長の本田　淳です。

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何卒、良いお年をお迎えください。

前置きはこれくらいにして・・・

今回はHIFU、ウルトラセルZi:に関する論文の紹介 4回目となります。

High-Intensity Focused Ultrasound Induces Adipogenesis via Control of Cilia in Adipose-Derived Stem Cells in Subcutaneous Adipose Tissue

2022年の論文になります。

以下は要約になります。

イントロ

事前にまとめておきます。この論文は、皮膚の老化に伴って減少する皮下脂肪組織（顔面の場合、頬のこけなど）を、高密度焦点式超音波（HIFU）を用いて増加させる手法を検証しています。特に、HIFUが脂肪組織由来幹細胞（ASCs）の繊毛（Cilia）に与える影響に着目しています。
皮膚の老化により、皮下脂肪組織（sWAT）の体積と脂肪組織由来幹細胞（ASCs）の脂肪生成能が低下することが知られている。
また、炎症性サイトカインがASCsの繊毛を短縮は、Wnt5a/β-カテニン(リンク先の原著論文では、繊毛形成が Wnt5a/β-カテニンシグナル伝達によって負に制御されることを示唆)の増加を介してASCsの脂肪分化能低下と関連があることも確認されている。

一方、高密度焦点式超音波（HIFU）は熱ショックタンパク質（HSP）をアップレギュレート（上方制御、発現を増加）し、炎症性サイトカインを低下させることが知られている。

目的

本研究では、HIFUがHSP70をアップレギュレートすることによって、炎症性サイトカインを抑制し、ASCsの繊毛を制御（仮説の段階で研究者が気付いていたかどうか不明ですが、繊毛の短縮を抑制するだけでなく、「脂肪細胞への分化に最適化した状態に調整する」、という意味があります）することができるか否かを検証した。

結果・結論

HIFUをエネルギー0.2 Jでラットの皮膚に照射し、1、3、7、28日目に組織を採取し分析した。
HIFU処置群と非処置群を比較した結果、HIFUはsWATにおけるHSP70をURし、NF-κB、IL-6、TNF-αの発現を抑制した。

また、ASCsにおいて繊毛分解関連因子（AurA、HDAC9）の発現を低下させ、繊毛形成関連因子（KIF3A、IFT88）の発現を増加させた。

さらに、HIFUはWNT5A/β-カテニンの発現を抑制し、脂肪生成マーカー（PPARγ、CEBPα）の発現を増加させ、sWAT内の脂肪細胞数およびsWAT厚を増加させた。

これらの結果は、HIFUがASCsの繊毛を制御することでsWATの量を増加させ、リジュビネーション治療に活用できることを示唆している。

以下は、セミプロレベルの内容（全文の抜粋要約）になりますので、

ご興味のある方のみ、どうぞ。

専門用語は込み入っていますが、ロジックは小学生でも理解できるような内容です。

イントロ

皮膚の老化は、美容分野で最も重要視される問題の一つであり、内因性要因と外因性要因が複雑に絡み合った現象である。内因性老化は加齢による自然なプロセスであるが、外因性老化は主に紫外線曝露が原因で進行する。

これらの老化過程により活性酸素種（ROS）の生成が増加し、DNA損傷や皮膚の炎症が引き起こされる。酸化ストレスの増加は、核内因子κB（NF-κB）の活性化を促進し、その結果、炎症性サイトカインであるIL-1、IL-6、TNF-αの発現が増加する。また、皮膚の老化は、真皮の厚さの減少や、皮下白色脂肪組織層（sWAT）の減少など、組織学的な変化を伴う。

成人の場合、組織の恒常性の維持や修復には、前駆細胞の増殖と分化を通じた組織特異的な細胞の更新が不可欠である。脂肪由来幹細胞（ASCs）は脂肪組織内に豊富に存在する前駆細胞群で、複数の系統への分化能力を持ち、増殖して新たな脂肪細胞に分化することが可能である。

しかし、加齢とともにASCsの脂肪細胞への分化能および増殖能が低下することが知られている。
脂肪細胞分化の制御および脂肪細胞の形質維持に不可欠な転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）の発現も、加齢により減少することが報告されている。

一次繊毛（primary cilia）は細胞表面に位置するアンテナ状の構造であり、細胞外環境からの刺激を感知してHedgehogシグナルやカノニカルおよびノンカノニカルWntシグナルなど、さまざまなシグナル伝達経路を調節する。

繊毛の形成（assembly）や分解（disassembly）に伴う長さの変化は細胞周期と密接に関連しており、一次繊毛は細胞の成長や増殖において重要な役割を果たしている。
さらに、一次繊毛は幹細胞や前駆細胞の「幹細胞性」（自己複製および分化能力）の維持に欠かせない要素である。

実際、ASCの分化過程では一次繊毛の長さが変化し、間葉系幹細胞（MSC）の脂肪細胞への分化過程では繊毛を持つ細胞の数が増加する。また、繊毛に不可欠なタンパク質である鞭毛内輸送タンパク質88（IFT88）の欠失は、一次繊毛の形成を妨げ、脂肪細胞への分化を抑制する。脂肪細胞への分化を阻害するWnt5a/β-カテニンシグナルは、脂肪細胞への分化過程においてMSCが繊毛を形成することによって減少する。

一次繊毛は、Wntシグナル伝達経路を抑制する役割があう。その証拠として、KIF3タンパク質を欠損させると線毛が破壊され、Wntシグナルが活性化する。一方、Wnt/β-カテニンシグナルが活性化すると、脂肪細胞の分化に不可欠なC/EBPαとPPARγの発現が抑制されることが知られている。

IL-6およびTNF-αで処理された栄養膜細胞（trophoblastic cells）では、一次繊毛が短縮することが確認されている。さらに、肥満患者由来のASCsでも繊毛の短縮が見られ、この現象は脂肪組織内の炎症性サイトカインの増加と関連している。

HSPは、機械的ストレス、ヒートショック、発熱、炎症、感染症といった外的要因や病理生理学的ストレスによりレベルが上昇する。また、正常な発生過程におけるストレスもHSPレベルを上昇させる。
また、HSP70は幹細胞の生存率を向上させることが知られている。さらに、HSP70はリポ多糖（LPS）刺激によるNF-κB活性化を抑制し、LPS活性化単球におけるIL-6およびTNF-αといった炎症性サイトカインの抑制をもたらす。HSP70によるNF-κBの調節は、主にマクロファージなどの免疫細胞で確認されているが、呼吸器の上皮細胞においてもNF-κBの活性化を抑え、TNF-αの産生を減少させることが示されている。

HIFUは、脂肪細胞に熱損傷と破壊を引き起こして壊死を誘発する。また、HIFUはコラーゲン合成を促進し、皮膚のリジュビネーション治療に広く活用されている。壊死した脂肪細胞の破片はマクロファージを活性化し、これが線維芽細胞によるコラーゲン合成をアップレギュレートする。さらに、HIFUはHSP27、HSP60、HSP70、HSP72、HSP73等をアップレギュレートすることも知られている。

一方、HIFUが皮膚内のASCsを刺激して脂肪細胞への分化を促進するかどうかは未解明な部分が多い。
本研究では、HIFUがHSP70の発現を増加させることで、sWAT内のNF-κB、IL-6、TNF-αといった炎症性サイトカインの活性を低下させるという仮説を立てた。

この炎症性サイトカインの減少は、sWAT内のASCsの一次繊毛機能を回復させる可能性がある。繊毛機能が回復するとWnt5/β-カテニン経路が抑制され、最終的には脂肪分化の主要転写因子であるPPARγおよびCEBPαの発現が増加する。この結果、皮下脂肪層での脂肪分化が促進され、sWATの厚さが増加する。
このsWAT厚の増加が、顔のリジュビネーションに寄与すると考えられる。

以上を踏まえ、本研究では、HIFUがラットの皮膚のASCsの繊毛を調節することで、皮下脂肪生成にどのような影響を与えるかを検証した。

結果

HIFUはHSP70を増加させ、NF-κB、IL-6、TNF-αを減少させた

HIFU照射後、皮下白色脂肪組織（sWAT）におけるHSP70の発現増加を検証した。
HIFUはラット皮膚に0.2 Jで照射され、1、3、7、28日目に組織を採取した。
ちなみに、HIFUを0.2 Jでブタの皮膚に照射した場合、組織温度が約40℃に達することを確認した。

HSP70の発現は、3,3-ジアミノベンジジン（DAB）染色を使用して測定した。HIFUを照射したsWATでは、HSP70の発現は非照射の対照群と比較して、照射後1日目に有意に高かった。HSP70の発現は1日目に最大となり、その後、時間経過とともに徐々に減少した (Figure 1a,b)。

HIFU照射後1、3、7、28日目の皮下白色脂肪組織（sWAT）におけるNF-κBの発現は、対照群と比較して有意に低下していた (Figure 1c,d)。また、HIFUはsWAT内のIL-6発現を抑制し、IL-6の発現はHIFU照射後1日目に最も低い値を示した。その後、時間とともに増加したが、HIFU照射後28日目でも対照群より低いレベルを保っていた (upper rows of Figure 1e,f)。さらに、HIFU適用後1、3、7、28日目におけるsWATでのTNF-αの発現は、全ての期間で対照群より有意に低かった (lower rows of Figure 1e,g)。
HIFUはASCsにおける繊毛分解関連タンパク質の発現を抑制した

オーロラキナーゼA（AurA）およびヒストン脱アセチル化酵素6（HDAC6）は、繊毛分解を担う主要な因子である。皮下白色脂肪組織（sWAT）におけるASCsの繊毛分解状態を評価するため、ASCマーカーであるCD166とAurAまたはHDAC6の共染色を実施した。

HIFU照射により、ASCsにおけるAurAの発現は対照群と比較して有意に低下した。AurAの発現は、HIFU照射後7日目に最も低いレベルに達した (Figure 2a,c)。

HIFU照射後1日目には、ASCsにおけるHDAC6の発現が対照群と比較して減少しており、その減少はHIFU照射後3日目および7日目にさらに顕著となった(Figure 2b,d)。
HIFUは繊毛形成関連タンパク質を増加させ、Wnt5a/β-カテニンを減少させた

ポロ様キナーゼ1（Polo-like kinase 1: PLK1）は繊毛分解に関与しており、この発現はHIFU照射後1日目に対照群と比較して低下し、HIFU照射後3日目に最も低い値を示した(Figure 3a,b)。

KIF3AおよびIFT88の発現は、HIFU照射後1日目から対照群のsWATと比較して有意に増加し、HIFU照射後3日目に最も高いレベルに達した (Figure 3a,c,d)。

WNT5Aおよびβ-カテニンの発現は、HIFU照射後1日目から対照群のsWATと比較して有意に低下し、HIFU照射後3日目に最も低い値を示した(Figure 3a,e,f)。

ASCsにおける繊毛形態の変化を評価するため、繊毛特異的マーカーArl13b（green）とASCマーカーCD166（red）の共染色を行った。HIFU照射後3日目に繊毛は最も長く伸長した(Figure 3g)。
HIFUはsWAT内の脂肪細胞分化を促進した

HIFU照射後1日目、皮下白色脂肪組織（sWAT）における脂肪分化マーカーであるPparγおよびCebpαのmRNA発現は、対照群と比較して有意に増加していた。これらの発現はHIFU照射後7日目に最も高い値を示した (Figure 4a,b)。

HIFU照射後1日目における皮下白色脂肪組織（sWAT）の脂肪細胞数は、対照群と比較して有意に増加しており、HIFU照射後7日目に最も多くなった(Figure 4c,d).。

sWATの厚さはHIFU照射により有意に増加し、その後も時間経過とともにさらに増加した(Figure 4c,e)。

考察

近年、皮膚の老化プロセスにおいて顔の皮下脂肪組織（sWAT）が変化することから、sWATは顔のリジュビネーション治療のターゲットとして注目されている。

加齢に伴いsWATの構造および体積は変化をきたす。また、脂肪細胞分化能も年齢とともに低下し、これに伴いPPARγの発現も減少する。これらの変化は皮膚の力学的特性を変化させ、皮膚の構造を維持するのに必要な限界歪みが低下し、しわが生じる要因となる。

一次繊毛の長さは、組み立て（assembly）と分解（disassembly）によって制御され、細胞周期の制御に関わる。繊毛が形成されると細胞は分裂を止め、繊毛が分解されると細胞は分裂を開始する。
一次繊毛はMSCを含む様々な幹細胞の維持と分化に関わっている。
IFT88やKIF3Aというタンパク質の機能を抑制して繊毛を失わせると、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化がうまくいかなくなり、脂肪細胞の分化に重要なPPARγの発現も低下する。
マウスの細胞においてKIF3Aをノックダウンして繊毛を失わせると、Wnt/β-カテニンシグナルが増強する。
これらのことから、脂肪由来幹細胞における繊毛の長さを調節することで、皮下脂肪組織における脂肪生成を誘導し、皮膚のリジュビネーションを促進できるとする仮説を立てた。

HIFU機器は、非侵襲的に皮下脂肪を溶解することによって、不要な脂肪を除去することが可能である。HIFUは細胞膜を即時破壊し、また58°Cに達する熱により凝固壊死に至らしめる。
ボディスカルプティング（皮下脂肪溶解）の目的でHIFU機器を用いる場合、140 J/cm²以上のエネルギー量で照射される。さらに、HIFUはコラーゲン合成を促進し、皮膚のたるみ改善にも使用されている。

IL-6やTNF-α等の炎症性サイトカインの増加は、繊毛を短縮させる原因となる。一方、HSP70はこれらの炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）を減少させることが知られている。

過去の研究では、約43℃の軽度の温熱（hyperthermia がどちらの意味で使用されているのか？・・・原著論文全文は見られませんでしたが、mild と書いてあるので、いわゆるハイパーサーミア・温熱療法でしょう。考察でも触れられます）によるヒートショックが、歯髄および歯髄細胞においてHSP27、HSP70、HSP90をアップレギュレートしたことが確認されている。さらに、ヒートショックは、細胞を培養する際に細胞生存率を向上させる効果的な方法となりうることが、多くの研究で示されている（原文では複数の実例が挙げられています）。

本研究では、炎症性サイトカインによって低下したASCsの繊毛機能を、HSP70をアップレギュレートさせることによって回復させることを企図した。
HIFU照射による組織の目標温度は40℃に設定し、0.2Ｊで照射を行った。

sWATにおけるHSP70の発現は、照射後1日目に最大値を示した。その後は時間経過とともに減少したものの、照射後28日目まで対照群より高いレベルを維持していた。同時に、HIFUはsWAT内のNF-κB、IL-6、TNF-αといった炎症性サイトカインの発現を有意に低下させた。

次に、炎症性サイトカインの減少がASCsの繊毛機能の回復に関連するか否かを検証した。
HIFU照射後、sWAT内のASCsで繊毛分解タンパク質（AurAおよびHDAC6）の発現が低下し、PLK1の発現も減少した。一方、繊毛形成に関与するKIF3aおよびIFT88の発現はHIFUにより増加した。また、繊毛の長さと負の相関を持つWnt5a/β-カテニンの発現はHIFU照射によって低下した。さらに、脂肪分化の指標であるPPARγおよびCEBPαの発現がHIFUによって増加し、それに伴いsWAT内の脂肪細胞数および組織厚が増加したことが確認された。

HIFUはHSP70を増加させ、炎症性サイトカインを減少させることで、sWATの脂肪細胞分化を促進することが示唆された。これは、HSP70が脂肪組織の炎症を抑制し、その結果ASCsの繊毛の長さを制御したと推測される。

ただし、HIFUによるHSP70の増加が炎症性サイトカインの減少に直接的に関与しているとは断定できない。なぜなら本研究でHSP70ノックアウトモデルを使用していないためである。今後の研究で、HSP70ノックアウトモデルを用いて、HIFUによるASCsの繊毛制御の正確なメカニズムを解明する必要がある。

リジュビネーション治療の新しいターゲットとしてsWATが注目されているにもかかわらず、sWATの厚みや体積を選択的に増加させる具体的な方法はいまだ報告されていない。

そこで、ハイパーサーミアの研究よりヒントを得て、HSP70 の発現を増加させることにより、sWAT 量を増加させることができるのではないかと仮説を立てた。そして、実際にHIFUを0.2 Jで照射することにより、HSP70をアップレギュレートさせられることを示した。

従来、HIFUは脂肪組織の破壊やコラーゲンの変性を目的とし、組織内で58℃を超える温度を生成する設定で使用されてきた。しかし、本研究では、上記の手法により、脂肪細胞の破壊を伴うことなく脂肪細胞分化を調節できることが明らかとなった。

この結果は、臨床応用の可能性を示唆しているが、確たるエビデンスを得るには、今後の臨床研究が必要である。
結論
HIFUはHSP70をアップレギュレートし、その結果、sWATにおけるNF-κB、IL-6、TNF-αといった炎症性サイトカインの発現を低下させた。この炎症性サイトカインの減少は、繊毛分解タンパク質の発現低下と形成タンパク質およびWnt5a/β-カテニンの発現増加を伴っていた。さらに、動物モデルにおいて、HIFUは脂肪細胞分化シグナル（PPARγおよびCEBPα）の発現を促進し、脂肪細胞の数およびsWATの厚さを増加させた（下図）。

メソッド

HIFUシステム

本研究では、HIFUシステム（LinearZ 日本名ウルトラセルZi:, Jeisys Medical Inc., Seoul, Korea）を使用した。トランスデューサは固有の周波数を持ち、2 MHz（焦点深度9.0–13.0 mm）、4 MHz（焦点深度4.5–6.0 mm）、および7 MHz（焦点深度1.0–3.0 mm）で動作する。このシステムには2つのモードがあり、DOTモードは焦点を1.0–2.0 mm間隔で形成する一方、LINEARモードでは焦点間にスペースを設けずに線形のエネルギーを生成する。最大出力エネルギーは3.0 Jである。

本研究では、7 MHzトランスデューサを使用し、焦点深度2.0 mmのDOTモードで照射を行った。照射エネルギーは0.2 Jであった。

温度測定法（略
HIFU照射
ラットは以下の5つのグループにランダムに分けられた（各グループ3匹）：HIFU 1日群、HIFU 3日群、HIFU 7日群、HIFU 28日群（それぞれHIFU照射後1、3、7、28日目にサンプルを採取）、および対照群（HIFU非照射）。ラットにはHIFU（DOTモード、深さ2 mm、0.2 J）が照射され、HIFU照射後1、3、7、28日目に皮膚およびsWATを採取した
諸検査手技について（略
統計解析

各実験のデータは、少なくとも3回の繰り返しから得られた結果を基に検証し、平均値 ± 標準偏差で示した。本研究では、5つのグループ間比較にKruskal–Wallis検定を用い、事後解析としてMann–Whitney U検定をSPSS v.22（IBM Corporation; Armonk, NY, USA）を使用して行った。統計的有意性は以下のように記載した： *（対照群との比較）、$（HIFU 28日群との比較）

以上となります。

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