パネルクイズアタック25のルールは、4人の参加者が赤 (■)・緑 (■)・白 (■)・青 (■)の4色に分かれて戦う。各色の回答ボタンを押した際の音と、パネルにその色が点灯する際の音は、赤→緑→白→青と席が右側に移るにつれて高い音（つまり赤が一番低い音、青が一番高い音）になっている。早押し問題が出題される。解答者がボタンを押したところで各問題全体での読上げが止まり、司会が解答者を指す。通常は「赤!」という風に、色の名前を呼ぶ。
正解者が出ると、ボード上の1から25までの数字が書かれたパネルのうち1枚を獲得できる。その後、色が下に記したルールに従って変わっていく。入れるパネルの番号は正解した解答者がコールする。パネルの入れ直しはできない。
最終的に、自分の色のパネルの枚数を競う。解答者のスコアはパネルの獲得枚数で決めるため、「○点」とは言わず、「○枚」と言う。クイズの正解数は勝敗に関係せず、パネルの取り方に戦略性が求められる。
最初の正解者は、必ず13番のパネルを獲得する。13番のコールは司会者が行う。1985年の一時期は1番から25番までがランダムに光るパネルを解答ボタンで押して止めて最初のパネルの場所を決めていたが、数回で廃止された。その際流れるBGMは、その後フラッシュオンクイズで再利用された。
