SARS-CoV-2の抗体耐性感染を細胞外小胞が媒介する。
(概要）
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は世界的なパンデミックを引き起こしている。
抗体耐性は中和抗体療法を弱め、現在の世界的なコロナウイルス（COVID-19）ワクチンキャンペーンを脅かしている。
SARS-CoV-2の耐性変異体の出現に加え、SARS-CoV-2がどのようにして抗体を回避するのかについてはほとんど分かっていない。
本論文では、SARS-CoV-2が細胞外小胞（EV）を介して細胞間に感染し、中和抗体から逃れる新しいメカニズムを報告する。SARS-CoV-2のエンベロープタンパク質を発現する細胞で最初に観察されたこれらのEVは、Vero E6、Calu-3、HPAEpiC細胞などの様々なSARS-CoV-2感染細胞が、感染によりパイロプトーシスを起こして分泌される。
SARS-CoV-2感染細胞は、これまでに報告されているウイルス生成小胞よりもはるかに大きなサイズ（直径1.6〜9.5μm、平均直径>4.2μm）を特徴とする同様の小胞を産生することがわかった。
透過型電子顕微鏡による解析とプラークアッセイにより、これらのSARS-CoV-2誘導EVは生きたウイルス粒子を大量に含んでいることが明らかとなった。
特に、ベシクルを被ったSARS-CoV-2ウイルスは、中和抗体に対して抵抗性があり、報告されている受容体や補酵素とは無関係にナイーブ細胞に再感染することができることが明らかになった。
また、ベシクルを介したSARS-CoV-2ウイルスの細胞間伝播は、ベシクルが直接受信者の細胞に取り込まれることを示唆する3D画像を構築した。
今回の研究成果は、SARS-CoV-2の細胞間感染を介した受容体非依存性の新規感染機構を明らかにし、SARS-CoV-2の抗体耐性に関する新たな知見を提供するとともに、将来の抗ウイルス剤の標的として有望であることを示唆している。
はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は爆発的に増殖し、無症状感染から呼吸不全、さらには死に至るまで様々な臨床症状を呈する1、2、3型である。SARS-CoV-2はベータコロナウイルス属に属する新規ウイルスで、過去20年間に大規模な集団感染を引き起こした他の2つのコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）および中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）に高い類似性を示しています4,5。これまでの研究で、SARS-CoV-2のライフサイクルは、スパイク（S）タンパク質が宿主細胞表面の受容体であるヒト・アンジオテンシン変換酵素2（hACE-2）に古典的に結合することから始まることが判明しています。膜プロテアーゼであるセリン2（TMPRSS2）によるS1/S2部位の切断とリソソームのカテプシンLによるウイルス細胞膜の融合がウイルス侵入の効率を決定する6,7,8,9. シングルセルシークエンスデータによると、hACE-2受容体は、心臓、肝臓、脳、肺、気管などの特定の組織において、発現レベルの低い1％未満の細胞で発現しているが、これらの臓器でSARS-CoV-2 RNAが依然として検出されることがある10,11,12,13. 注目すべきは、SARS-CoV-2が肺に深刻なダメージを与えるが、肺細胞におけるhACE-2の発現は、いくつかの肺外の組織における発現よりも低いということである14,15,16。さらに、COVID-19患者の肺では、hACE-2の発現は上昇していなかった17。したがって、SARS-CoV-2が宿主細胞に侵入するための未認識の経路がまだ存在するかもしれないという仮説を立てる研究者もいる。最近の2つの研究では、Sタンパク質のフリン切断基質となるニューロピリン-1（NRP-1）という追加因子が、SARS-CoV-2の感染性を高める可能性があることがわかった18, 19. さらに、最近の研究では、新規の候補受容体であるチロシン-プロテインキナーゼ受容体UFO（AXL）がSARS-CoV-2のSタンパク質と特異的に相互作用し、「アポトーシス模倣」を介してhACE-2の過剰発現と同様に効率的にウイルス侵入を促進することが明らかにされた。AXLを抑制することで、肺細胞のSARS-CoV-2感染が抑制されることがわかった11。これらの重要な発見は、SARS-CoV-2の感染に関する理解を深めるだけでなく、抗SARS-CoV-2薬や抗体を開発するための新しい展望を提供するものである。
中和抗体は、SARS-CoV-220に対する治療競争において、最先端の抗ウイルス戦略として提案されている。現在の抗体療法は、抗ウイルス療法と抗炎症療法に分けられる。抗体療法の中でも、患者に即時受動免疫を与える可能性のある回復期血漿（CP）療法が大きく注目されている21,22。しかし、CP療法は最適とは言えず、呼吸不全を回復させ死亡率を低下させることはできない23,24。もう一つの有望な治療法は、主にウイルス膜のSタンパク質または宿主細胞形質膜のhACE-2受容体を標的とし、それによってウイルスとその受容体の結合を阻止するように設計されたモノクローナル抗体であった。現在までに、Sタンパク質を標的とする少なくとも8つの抗体候補が、さまざまな段階の臨床研究に入っている20。Lilly社のLY-CoV555抗体は、COVID-19の治療薬としてFDAの緊急使用認可を受けた最初の中和抗体である。第II相試験において、LY-CoV555は、軽度または中等度のCOVID-19と診断された外来患者の2日目のウイルス量の自然減少を促進するように見えたが、重度のCOVID-19または病気が長引いた患者では同じ効果をもたらさなかった25,26。しかし、LY-CoV555はSARS-CoV-2亜型B.1.1.727に対して満足のいく治療効果を示さなかった。特に、変種に対して開発された「カクテル抗体」BRII-196とBRII-198は、有用性がないため早期に中止された28。SARS-CoV-2の自然変異の出現は、このウイルスを標的とする中和抗体の効果が不十分であることの主な理由である。SARS-CoV-2の変異体は、抗体の有効性と特異性を弱め、さらに新しいウイルス株を生み出し、既存の抗体に対して徐々に耐性を獲得していく可能性がある29,30。このように、SARS-CoV-2が抗体から逃れるという問題の解決には、多くの努力が必要である。
研究成果
SARS-CoV-2のエンベロープタンパク質は、ウイルス粒子を含む細胞外ベシクルを誘導する。
SARS-CoV-2の構造エンベロープ（2-E）タンパク質が一種のpH感受性カチオンチャネルを形成すること、そして2-Eチャネルの不均一な発現が宿主細胞死を引き起こすことを我々は以前に明らかにしている31。2-E 導入後、16 時間で細胞の膨潤と膜の突出が始まり、その後、母細胞から細胞外小胞（EV） が分泌されることを見いだした。約24時間後、細胞膜は破裂する前の膨らんだ「風船状」の外観を示した（補足図S1、S2aおよびビデオS1）。細胞死過程の最後に見られる膨張した「風船状」の気泡は、ネクロプトーシスやパイロプトーシスを含むネクロシスの典型的な特徴である32,33,34,35。試験したネクローシスの特徴のうち、ガスダミンE (GSDME) は、3つの細胞株 (Vero E6, A549, Hela) すべてで2-E発現時に2つのフラグメントに切断され、カスパーゼ-3と-7の活性化が同時に起こることがわかった (補足図 S2, S3)。アネキシン V（AV）およびヨウ化プロピジウム（PI）染色検査と合わせると、これらの上記結果は、2-E を介した細胞死において GSDME 切断がパイロプ トシスにつながることを示唆している33。
興味深いことに、2-E を発現した Vero E6 細胞からは、生物学的機能が不明な EV が多数分泌されて いることが走査型電子顕微鏡（SEM）により観察された（図 1a）。SEMでは、2-Eを発現した細胞体が丸くなり、スライド培養から細胞が部分的に剥離することが確認された。また、多くのEVが宿主細胞から突出して表面に付着しており、ブドウの房のような外観をしていた。排出されたEVは丸く、滑らかで、母細胞よりも小さかった（図1a）。1つの脱血細胞は1〜15個のEVを生成することができた（平均3個）。ミトコンドリアや小胞体（ER）などの細胞小器官の分離パラメータを参考に、2-E誘導型EV（2E-EV）は、複数回の最適化の後、差動遠心分離を用いて分離した36,37。2-E-EVs のサイズは、無作為に選んだ 100 個の EV の断面直径を顕微鏡で測定して確認した。72% の小胞は直径 3 ～ 6 μm、平均直径 4.3 μm であった（図 1b、c；補足図 S4）。
a 2-E をトランスフェクトした Vero E6 細胞とトランスフェクトした細胞から単離した EV の SEM イメージ。スケールバー、5μm
b 2-E-EVの単離を示すフローチャート
c 2-E-EVの直径の変化
d 2-E-mCherry発現Vero E6細胞の細胞死時の顕微鏡画像。
2-E-mCherryを導入した細胞の5つのステージが示されている。白矢印は2-E-EVを示す。e 2-Eを導入したVero E6細胞および2-E-EVのTEM画像。黄色の三角形は SMV、赤色のボックスは膨潤したゴルジ体、赤色の矢印は損傷したミトコンドリア、黄色の点線丸はリソゾーム。スケールバー：2μm（上）、0.2μm（下） f Vero E6細胞の顕微鏡画像。この細胞は、レンチウイルスベクター（Lenti-mNeonGreen-3×Flag）に感染させた後、2-E-mCherryプラスミドをトランスフェクトして小胞を誘発させたものである。スケールバー、10μm。左隅の図は、使用したウイルスとプラスミドの模式図である。2-E とレンチウイルスの C 末端には、それぞれ mCherry（赤）と mNeonGreen（緑）のタグが付加されている。 g 左：単離した 2-E-EV の mCherry と Flag のシグナルを示すイムノブロット。全てのレーンに同量の全タンパク質をロードした。右：単離2-E-EV中のレンチウイルスを示す核酸ゲル画像。h 感染実験の模式図。Vero E6細胞にまず2-E-mCherryプラスミドをトランスフェクトし、次にSARS-CoV-2に感染させた。翌日、細胞、上清、および2-E-EVを回収した。 i 2-E-mCherryプラスミドによるトランスフェクションおよび感染後のSARS-CoV-2のコピーのqRT-PCR分析。ヒストグラムは、細胞（左）、上清（中）、および単離2-E-EV（右）中のウイルスコピー数を示している。データは少なくとも3つの独立した実験の平均値±SEMである。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; unpaired Student's t-test.
2-E がどのように EV の分泌を促進するかを理解するために、まず 2-E-mCherry プラスミドを導入した Vero E6 細胞でブリービングプロセスを可視化した（図 1d、補足図 S5、ビデオ S1-S3）。このビデオでは、EVの3つの主要な特徴である、脱落、スライド、融合を明らかにし、EVが母細胞からその直近の微小環境内だけでなく、遠くの他の細胞へも移動する可能性を示唆した。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、EVの内部を観察した。2-E タンパク質発現後、細胞の超微細構造は大きく変化していた。まず、多数の一重膜液胞（SMV）が出現した。これらのSMVは、直径がそれぞれ79.9 ± 31.2 nmと252.2 ± 148.9 nmの2つのサブグループに分けられる（図1e、黄色の三角形）。次に、ライソゾームの数が細胞内で著しく増加した（Fig. 1e、黄色の点線丸）。最後に、ER、ミトコンドリア、ゴルジ体が膨張していた。さらに詳しく観察すると、ゴルジ体やミトコンドリアがいくつかの液胞を繋いでいることがわかった（図1e、赤枠と赤矢印）。驚くべきことに、脱落したEVは母細胞と同様の超微細構造特性を有している。図 1e の右図に示すように、代表的な EV には、大小の SMV が同時に多数出現していた（図 1e、黄色い三角形）。さらに、EVの内部には多くのリソソームも観察された（図1e、黄色の点線丸）。
SARS-CoV-2 は、リソソームを利用して排出する可能性があることが以前から示されている38。我々は、2-E-EV がウイルスをパッケージングする可能性もあると推測した。この仮説を検証するために、まずウイルスシミュレーションベクターとして、緑色蛍光タグを持つレンチ ウイルスを構築した（Lenti-mNeonGreen-3×Flag）。このレンチウイルスをVero E6細胞に感染させ、2-E-mCherryプラスミドをトランスフェクトし、EVを誘導した。2-EプラスミドのみをトランスフェクトしたVero E6細胞をコントロールとして使用した。図 1f に示すように、赤色の EV は確かに緑色のウイルス粒子を包んでいることがわかり、成熟したレンチ ウイルスの粒子が母細胞から EV に分泌されたことが示唆されました（図 1f）。また、レンチウイルス感染群から分離した赤色EVには、一貫して高レベルのレンチウイルス（抗Flag）が検出された。一方、コントロール群から分離したEVには、2-Eタンパク質（抗mCherry）のみが含まれていた（図1g、左）。また、レンチウイルス特異的プライマーを用いたPCRでも、EVがレンチウイルスをパッケージングしていることが示唆された（図1g、右）。次に、2-E-EVがSARS-CoV-2をパッケージングできるかどうかを検討した。Vero E6 細胞に 2-E-mCherry プラスミドをトランスフェクトし、SARS-CoV-2 を感染させた（図 1h）。細胞、上清、単離したEV中のSARS-CoV-2量を、SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) を認識する定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR) を用いて検討した。EV中のウイルスコピー数は1×1011個/mL以上であり（図1i）、2-E-EVがSARS-CoV-2をパッケージングできることが確認された。
SARS-CoV-2感染による細胞外ベシクルの生成
そこで、SARS-CoV-2感染によってEVが生成されるかどうかを、様々な細胞で検証した。その結果、SARS-CoV-2感染Vero E6細胞の細胞膜も膨張していることがわかった。その後、細胞体は丸みを帯び、ブリービングへと進行した（図2a）。感染母細胞からは、5個以上のEVが突出して表面に付着しており、ブドウの房のような形をしていた。2-E-EV の単離と同様の方法で、SARS-CoV-2 誘導 EV (CoV-2-EV) を単離し、その後計測したところ、81%が直径 3～5 μm、平均直径 4.9 μm の小胞だった（図 2b）。興味深いことに、CoV-2-EVのサイズは、エキソソーム（0.04-0.15μm）、マイクロベシクル（0.05-1μm）、アポトーシス小体（0.5-2μm）など、これまでに報告された他のウイルス生成小胞のサイズよりはるかに大きい39、40，41．特に、感染ヒト気道上皮細胞株Calu-3やヒト肺胞上皮細胞株HPAEpiCにおいても、同様の突出・脱落EVが観察された（図2c）。さらに、SARS-CoV-2感染の実験動物モデルとして広く用いられているゴールデンハムスターのSARS-CoV-2感染肺を検討した。ゴールデンハムスターにSARS-CoV-2の104 50％ tissue culture infective dose (TCID50) またはコントロールとしてDMEM培地を経鼻的に感染させた。感染後3日目（3dpi）に肺を採取し、ウイルスの複製と病理組織学的変化を観察した。肺のウイルス量は3dpiで106copies/μg RNAに達した。3dpiでウイルス抗原が検出された領域では、単核細胞の浸潤が観察された。また、腫脹・脱落した組織には、ウイルスのクラスターが検出された（補足図S6）。次に、各サンプルの異なる切片をSEMで観察した。興味深いことに、対照群では明らかな変化が観察されなかったが、気管支および肺胞ネットワークの細胞外側に多数の小胞構造がドッキングしていた（図2d、n＞3）。また、損傷した肺から排出された小胞も捕捉された（右列、黄色い三角形）。90%の小胞の断面径は3.5～5.5μmで、平均径は4.2μmと、試験管内で観察されたEVの径に近かった（Fig. 2e）。また、最近の研究では、COVID-19患者の血液中に異なるサイズのEVが検出され、病気の重症度に関連していることが報告されている42。これらの結果は、SARS-CoV-2感染において、EVが生理的な関連性を持つことを裏付けている。
a SARS-CoV-2を感染させたVero E6細胞（MOI = 1）のSEM画像 b SARS-CoV-2を感染させたVero E6細胞から得られた小胞の直径。c SARS-CoV-2を感染させたCalu-3（MOI = 2）およびHPAEpiC細胞（MOI = 5）由来の細胞およびEVのSEM画像。 d 健常ゴールデンハムスター肺組織およびSARS-CoV-2感染肺組織のSEM画像。e SARS-CoV-2感染ゴールデンハムスター肺組織由来の小胞の直径範囲。 f 2-E-mCherryとゴルジ体EGFP（B4GALT1-EGFP）を共導入した単離2-EVの画像。2-EV膜上で2-E-mCherryとゴルジ体マーカーが共局在していることがわかる。g 赤と緑のシグナルの相関を示す線形回帰分析。 h Vero E6細胞にGolgi-EGFPを導入し、SARS-CoV-2を感染（MOI = 1）させた（右）。画像は感染後、指定された時間に撮影された。スケールバー：2 μm (f), 5 μm (a, c, d, h).
細胞の機能には、細胞膜の他に、核膜、リソソーム、ゴルジ体、小胞体などの内膜系が不可欠である。その中でも、ERとゴルジ体はSARS-CoV-243の生活環に関与していることが報告されている。これらの EV の起源となる可能性を探るため、まず、3 種類の細胞内膜マーカー、plasma-EGFP、ER-EGFP および Golgi-EGFP を 2-E プラスミドと共導入した。3 種類のマーカーのうち、2-E-EV の膜はゴルジマーカーが強陽性で、プラズマ膜マーカーはスポット陽性であった。定量分析により、単離された EV はゴルジ体膜で構成され、2-E と共局在している（80%以上）ことが確認された（図 2f, g; 補 足図 S7）。さらに、EVの産生・分泌過程におけるゴルジ体膜の運命を検討した。初期段階（トランスフェクション後10-12時間）では、2-E-mCherryは主に未同定の核周辺コンパートメントに集積した。約16時間後、ゴルジマーカーで標識されたEVが細胞表面から出現し、急速に放出された（補足図S8）。このように、ゴルジ体膜は分泌され、2-E-EV の形成に寄与していた。CoV-2-EV の膜も 2-E-EV と同様に Golgi-EGFP が陽性であり、ゴルジ体膜が EV の形成に寄与していることが示唆された（図 2h）。これらの EV の起源を明らかにするために、さらなる脂質分析が必要である。
SARS-CoV-2 誘導小胞は多数のウイルス粒子を含む
SARS-CoV-2感染細胞および分泌されたEVの超微細構造解析をさらにTEMを用いて行った。SARS-CoV-2 感染細胞では、ゴルジ体、ミトコンドリア、ER にも変化が見られ、膨潤、蝸牛内空間やマトリックス密度の増加が見られた（図 3a、赤矢印）44,45。CoV-2-EVに特徴的な複数の視覚野が捉えられていた。第一に、脱落したCoV-2-EVには多数の高密度なウイルス粒子とミトコンドリアが存在した。第二に、多数のSARS-CoV-2ビリオンが、排出されたCoV-2-EVに内包されていた（図3a、黄色の点線丸）。これらのビリオンの平均直径は75±10 nmであり、以前の報告と一致していた43。CoV-2-EV中のSARS-CoV-2ビリオンの存在をさらに確認するために、SARS-CoV-2ヌクレオキャプシド免疫金標識による免疫組織化学的解析を行った。SARS-CoV-2感染（MOI = 1）したVero E6細胞では、細胞質内と細胞内に蓄積したウイルス粒子でヌクレオキャプシドの強い標識が見られた（図3b）。排出されたCoV-2-EVでは、細胞内容物に加え、ウイルス粒子も確認でき、金色の粒子でマークされていた（図3b、黄色の矢印）。また，プラーク還元法およびqRT-PCR法から，これらのCoV-2-EVには，2.3×107 PFU/mLおよび2×109 viral copies/mLという多数の感染性ウイルスが存在することが裏付けられた（図3c-e）．このことは、冗長な 2-E タンパク質が、ウイルスの生成、パッケージング、あるいは EV の分泌を促進している可能性を示唆している。
a SARS-CoV-2を感染させたVero E6細胞のTEM画像。青い三角形は二重膜小胞（DMV）、赤い三角形はSMV、黄色の点線円はウイルス粒子、赤い矢印は損傷したミトコンドリア、青い点線円はリソゾーム（MOI = 1）。 b SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド免疫金標識による感染Vero E6細胞の免疫電子顕微鏡分析（MOI = 1）。黄色の矢印は、ウイルス粒子。Vero E6細胞にSARS-CoV-2を感染させた。d SARS-CoV-2感染Vero E6細胞の上清および単離EV中のSARS-CoV-2 RNAのqRT-PCR解析 e CoV-2-EVのプラーク縮小アッセイ。データは平均値±SEMである。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; unpaired Student's t-test.
SARS-CoV-2が誘導する小胞は、ウイルスが中和抗体から逃れ、生産的な感染を確立するのを助ける
いくつかの先行研究では、エクソソームなどのEVが、中和抗体からウイルスを保護することが報告されている46,47。そこで、CoV-2-EVが同様の機能を果たすかどうかを検討した。SARS-CoV-2に対する中和抗体として、2つの報告されているものを概念実証として使用した。一つはHEK293細胞からのリコンビナントモノクローナル中和抗体で、リコンビナントスパイクRBD-mFcタンパク質（nAb-1）48を認識するものである。もう一つは、超免疫ウマ血漿から得られたRBD特異的免疫グロブリンF(ab') 2フラグメント（nAb-2）49である。これら2つの抗体の中和効率はin vitroで検証された。SARS-CoV-2をVero E6細胞で1時間インキュベートした後、新鮮な培地に交換して除去した。0.01 MOIの生ウイルス感染条件下で、nAb-1抗体およびnAb-2抗体は、上清中のウイルス阻害に基づき、それぞれ0.59および0.05 μg/mLのSARS-CoV-2の生成を抑制できた（補足図 S9）。EVが介在する抗体耐性の可能性を評価するために、2組の実験を計画し、実施した。最初の実験では、感染条件を厳密に制御するために、遊離ウイルスとベシクル封入ウイルスに対する2つの抗体の中和効率を、等力価感染（MOI = 0.01）下で評価した（図4a）。興味深いことに、遊離ウイルス群ではnAb-1またはnAb-2によって感染がほぼ抑制されたが（図4b）、CoV-2-EV群ではnAb-1もnAb-2も健康細胞の感染を抑制することはできなかった（図4c）。第二の実験では、抗体治療過程をシミュレートするために、感染2時間後に中和抗体を培養プレートに添加した。感染24時間後にCoV-2-EVを分離し、CoV-2-EV中のウイルスコピーを調べた(Fig. 4d)。いずれの抗体もCoV-2-EV中の生きたウイルス量に対して無視できるほどの抑制効果を示し、抗体処理したCoV-2-EVは再感染能を保持していた（図4e, f）。変異に加えて、Sタンパク質に依存した細胞間伝播がSARS-CoV-2抗体の効果を減弱させる可能性があることが報告されている50。しかし、今回の結果は、CoV-2-EVが中和抗体からウイルスを保護することを示しており、SARS-CoV-2が抗体の中和から逃れる新しいメカニズムであることを示唆している。
a SARS-CoV-2 および CoV-2-EV 感染実験の模式図 b, c nAb-1 または nAb-2 で前処理したウイルス粒子 (b) および CoV-2-EV (c) 感染後の細胞および上清中の SARS-CoV-2 濃度の qRT-PCR 解析 d 2 次感染実験の模式図。Vero E6細胞に生きたSARS-CoV-2ウイルスを1時間感染させた後、中和抗体またはコントロールIgGタンパク質を添加した。CoV-2-EVは、図1bに記載したように、差動遠心分離によって上清から単離した。Naïve Vero E6細胞をCoV-2-EVと24時間インキュベートした後、新鮮な培地に交換した。f nAb-1またはnAb-2で前処理したCoV-2-EVによる二次感染後の細胞および上清中のSARS-CoV-2レベルのqRT-PCRによる解析である。データは3回の独立した実験の平均値±SEMである。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 解析は一元配置分散分析で行った。
CoV-2-EVは、SARS-CoV-2の細胞への侵入を、受容体の既知のレセプターとは無関係に媒介する。
EVは、SARS-CoV-2を不浸透性膜を通して中和抗体から保護することは論理的であるが、EVは一時的なリザーバーとしてのみ機能し、ウイルスは、古典的なウイルスレセプター経路を介してナイーブ細胞に感染するために、破壊されたEVから放出し続ける可能性があると言うことができる7、8、18、19。EVsがSARS-CoV-2の侵入および感染経路となりうるかどうかが検討された。まず、SARS-CoV-2の主要な受容体および補因子として報告されているhACE-2、AXL、NRP-1、TMPRSS2の発現レベルを7つの細胞株でスクリーニングした。その結果、3つの細胞株が選ばれ、さらに検討が進められた。Vero E6、Cercopithecus aethiops腎臓上皮細胞株、hACE-2、TMPRSS2、AXLを発現しているがNRP-1を発現していない、A549、ヒト肺胞上皮細胞株、AXL、NRP-1、TMPRSS2を発現しているがhACE-2を発現しない、SCC7、マウス皮膚がん細胞株、hACE-2, AXL, NRP-1 またはTMPRSS2を検出不可能（図5a）であった。これらの細胞株を遊離ウイルス粒子または単離CoV-2-EVとインキュベートした。その結果、hACE-2はVero E6細胞を遊離ウイルス感染に感受性にしたが、hACE-2を発現しない他の2つの細胞株は遊離ウイルス粒子に感受性を示さなかった（図5b）。一方、hACE-2、AXL、NRP-1、TMPRSS2の発現の有無にかかわらず、3つの細胞株すべてが単離CoV-2-EVに感染した（Fig.5c）。CoV-2-EVによるVero E6細胞の感染ウイルス力価は、感染後24時間で〜2.3 × 105 PFU/mL、48時間で1.7 × 106 PFU/mLであった（補図S10）。
(以下略）
