リプログラミング因子を持つプラスミドDNAの単純な一時トランスフェクションでのヒトiPS細胞樹立

ウィスコンシン医科大学のStephen A. Duncanらのグループにより、OCT4, NANOG, SOX2, LIN28をコードするプラスミドをトランスフェクションし、エピソームによる維持や選抜なしに、ヒトiPS細胞を樹立したという論文が発表されました。

BMC Dev Biol. 2010 Aug 3;10:81.

Generation of human induced pluripotent stem cells by simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors.
Si-Tayeb K, Noto FK, Sepac A, Sedlic F, Bosnjak ZJ, Lough JW, Duncan SA.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20682060?dopt=Abstract

BACKGROUND: The use of lentiviruses to reprogram human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells could limit their therapeutic usefulness due to the integration of viral DNA sequences into the genome of the recipient cell. Recent work has demonstrated that human iPS cells can be generated using episomal plasmids, excisable transposons, adeno or sendai viruses, mRNA, or recombinant proteins. While these approaches offer an advance, the protocols have some drawbacks. Commonly the procedures require either subcloning to identify human iPS cells that are free of exogenous DNA, a knowledge of virology and safe handling procedures, or a detailed understanding of protein biochemistry.RESULTS: Here we report a simple approach that facilitates the reprogramming of human somatic cells using standard techniques to transfect expression plasmids that encode OCT4, NANOG, SOX2, and LIN28 without the need for episomal stability or selection. The resulting human iPS cells are free of DNA integration, express pluripotent markers, and form teratomas in immunodeficient animals. These iPS cells were also able to undergo directed differentiation into hepatocyte-like and cardiac myocyte-like cells in culture.CONCLUSIONS: Simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors is sufficient to generate human iPS cells from primary fibroblasts that are free of exogenous DNA integrations. This approach is highly accessible and could expand the use of iPS cells in the study of human disease and development.

新生児包皮由来の線維芽細胞に、OCT4, NANOG, SOX2, LIN28をコードする4つのプラスミド（「ヒトiPS細胞の樹立 」で紹介したThomsonらのグループによって報告された論文でレンチウイルスを作製するために使われたプラスミドを使用）をコトランスフェクションし、1週間後に再度トランスフェクション、2週間後からMEK阻害剤であるPD0325901存在下で培養し、最初のトランスフェクションから4週間後にヒトiPS細胞様コロニーをピックアップしています。

アルフォス陽性コロニー数はレンチウイルスを用いた場合と同様で、3回の実験で計36コロニーがヒトES細胞様の形態を示したようですが、それらの大半は不安定であり、安定だった1ラインのみを後の解析に用いています。

このヒトiPS細胞株は、ヒトES細胞と形態が類似していること、アルフォス活性を持つこと、OCT4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81陽性、CD13陰性であること、テラトーマ形成を介して三胚葉分化できること、正常核型を持つこと、確かに線維芽細胞由来であること、外来DNAを持たないこと、肝細胞様細胞および心筋に分化誘導できることが示されています。