論文紹介：顔面色素沈着に対する高周波治療：統合的後向き臨床試験および体外研究1
本ブログにご来訪いただき、誠にありがとうございます。美容皮膚科 ペルラクリニック神宮前 院長の本田 淳です。当院は、院長が診察から治療まで一貫して施行すること（ワンドクター制）を特徴としています。◆ペルラクリニック神宮前Webサイト【 以前のメールアドレスinfo@perla-j.jp 】 は、現在ご利用になれません。メールでのご予約・ご相談の方は、以下のフォームhttps://perla-clinic-j.com/inquiryよりご連絡ください。お手数をおかけして申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。以下本文となります。―――――――――――――――――2026年の論文となります。Monopolar Radiofrequency for Facial Hyperpigmentation Treatment: An Integrated Retrospective Clinical Trial and Ex Vivo Study緑字は私の低レベルなコメントですので、お読みにならなくても結構です。本文を抜粋し、要約しています。 イントロ 著者はまず、ユーメラニンを皮膚の主要な光防御色素として位置づけ、UV吸収および活性酸素種・活性窒素種の緩衝という生理的意義[1,2]を確認している。 加齢皮膚では メラノサイト活性の亢進と調整機構の破綻が生じ[3]、それが 日光性色素斑、肝斑、PIH などの過剰色素沈着につながる[4]、という枠組みを提示している。 さらに、老化した真皮線維芽細胞が基底膜を障害、さらにメラノサイトの真皮への下降が生じ、melanocyte–fibroblast cross-talk （メラノサイト―線維芽細胞クロストーク）を増幅することで、色素沈着を増悪させる[5]と述べている。 かような病態の理解のもとに、著者は energy-based therapy、特に 高周波（RF）治療に着目している。 ここでは、先行する in vitro の bipolar RF 研究を根拠に、RF がチロシナーゼ 抑制、HSP70/90 上昇、ATP低下、線維芽細胞老化の軽減、リンパ管新生促進、ケラチノサイト における メラノサイトオートファジー 促進など、複数経路から メラニン合成を抑制しうる[5,6,7,8,9]と位置づけている。 すなわち、RFは単なる「熱によるリモデリング」ではなく、色素産生制御そのものにも介入しうる、という立ち位置。加齢皮膚ではメラノサイト活性の亢進もちろん、必ず亢進状態が起こるというわけではありませんし、色素異常は多くの要因が複合して生じます。老化した真皮線維芽細胞が基底膜を障害、さらにメラノサイトの真皮への下降が生じ、melanocyte–fibroblast cross-talk を増幅することで、色素沈着を増悪させるここは、様々な病型の病理学的現象をあえて簡略化して、一つのルートのように書いているものと思われます。原文ではpigmentary cross-talkという曖昧な書き方がされています。in vitro の bipolar RF 研究を根拠バイポーラの研究をMRFに外挿？？ 電場分布、時空間的エネルギー分布が、両者はかなり異なりますので以下略文献1は、美容領域の研究ではありません。メラニン合成そのものではなく、メラニン分泌（melanin secretion）が悪性黒色腫（cutaneous melanoma, CM）の浸潤性・転移性・免疫微小環境改変への関与について記述した総説・ナラティブレビューです。文献2について、皮膚色素異常をhyperpigmentationと hypopigmentation / depigmentationに大別し、原因、代表疾患、薬物療法、天然由来成分、さらにレーザー、マイクロニードリング、ケミカルピーリング、RF、プラズマペンまでを横断的に概説したナラティブレビューです。文献の採択基準やエビデンス階層が記載されておらず、内容的にも、肝斑をhypopigmentation 側に配置していたり、トラネキサム酸の作用機序の記述がおかしかったり・・・とやや問題の多い論文でした。文献3について、研究の目的は、p53 がhyperpigmentationにおいて、ケラチノサイト側の メラニン生成サイトカインと、メラノサイト側の受容体・メラニン合成関連因子の双方を、どの程度制御しているかを明らかにすることです。UVB-POMC 経路の再確認する意図ではなく、persistent hyperpigmentation （遷延性色素沈着）の維持機構としての p53 を検証する設計です。筆者の結論は「p53 を “master regulator” とみなし、ケラチノサイトとメラノサイトの双方で paracrine cytokine receptor signaling を統括し、皮膚過剰色素沈着の成立、持続に必須である」と示唆されています。p53をessential とまで言うのは過剰だと思いますが・・・細かく書いていると、これだけで一つのブログ記事になりますので、やめます。この調子だと、なかなか本論が進みませんので、以後、文献に関しては軽く触れるに留めます。各文献の問題点の指摘はあえて省略します。文献4について、加齢、光老化に伴う色素系変化を、老化細胞と細胞間クロストークを軸に再統合しようとした総説、ナラティブレビューです。加齢性色素変化はメラノサイト単独の問題ではなく、ケラチノサイト、線維芽細胞、血管内皮細胞を含む皮膚ユニット全体の老化と相互作用の破綻として理解すべきという仮説を述べています。詳細は以下略文献5について、以前ご紹介した記憶がありますが・・・日光性色素斑の局所では、真皮浅層に老化線維芽細胞が蓄積し、その表現型転換の一部として SDF1/CXCL12 発現が低下し、結果としてメラニン合成が亢進する、というものです。さらに、microneedle fractional RF により老化線維芽細胞を減少させ、SDF1 を回復させれば色素沈着が改善しうる、という治療的含意にまで言及しています。文献6について、著者ら自身の既報（RFが炎症性サイトカイン低下やメラノソームオートファジーを介して色素沈着を抑制する、と主張）の延長線上にある論文です。UV-Bで誘導した色素沈着に対して、RFが HSP70 を増加 させ、その結果として p53 → MC1R/CREB/MITF →チロシナーゼ系を抑制し、メラニン合成が減少する、という機序仮説を検証しています。ただし、RF全般ではなくPOTENZA を用いた 2 MHz の bipolar microneedling RF を扱った研究ですので、結論の外挿範囲はかなり限定的です。文献7は、UV-B誘導性色素沈着モデルに対し、RF照射がリンパ管新生（lymphangiogenesis）を介して真皮メラニン排出を促進しうるかを検証した前臨床機序探索研究です。RFは HSP90/BRAF/MEK/ERK 活性化 → チロシナーゼ抑制 → VEGF-C/VEGFR3 系活性化 → リンパ管新生と排出増強 → 真皮メラノファージ由来メラニン除去 という連鎖で、UV-B誘導性色素沈着を軽減すると結論づけています。正直、因果連鎖が実証されたとは以下略文献8は、かなり複雑ですので簡単に説明しづらいのですが・・・UVBで刺激されたケラチノサイトからのATP放出が、CD39/CD73‐アデノシン‐A2A/A2B受容体‐AC‐cAMP‐PKA‐CREB‐MITF軸を介してメラノサイトのメラニン合成を促進しうる、という仮説に基づき、RF照射がこの経路を抑制しうるか否かを検証しています。要は、RFの色素沈着抑制効果について従来のHSP70やオートファジー経路だけでなく、上流イベントから説明しようとする試みです。文献9は、は、UVB誘導性メラノジェネシスを、従来の α-MSH/MC1R/cAMP/MITF 軸だけでなく、角化細胞由来ATP → CD39/CD73 → アデノシン受容体 A2A/A2B → AC → cAMP/PKA というパラクリン経路から再構成し、その上流にRFの介入点を置こうとしています。そもそも、文献6～9は同一研究クラスタの連作です。実験プラットフォームも同一ですので・・・別々の機序仮説を行い、段階的に「増築」したという印象です。当該論文は、これらを踏み台にしているのでしょう。 MRF は、すでにコラーゲンリモデリング、弾性の改善、皮下脂肪減少、線維芽細胞再生、眼周囲シワ改善などに実績があり、美容市場での存在感が高い[5,10,11,12,13,14]、と位置づけている。 著者は MRF の特徴を “bipolar RF より深い bulk heating” とし、それがより包括的なスキンリジュビネーションをもたらし、ひいては真皮内の深いメラニン沈着にも作用しうる[15]、と述べている。 その仮説を支持する臨床文献として、MRF＋1% コウジ酸 による 改善[16].、MRF＋非侵襲的ダイオードレーザーによる 色素異常の改善[17]、さらに micro-plasma RF[18]、sublative fractional RF[19]、microneedle RF[20]、invasive bipolar alternating current RF [21]等、RF系全般が色素異常に対する治療に適用されてきた事実を列挙している。文献10について、RFが脂肪組織減少に有効であるというエビデンスの有無と、そのエビデンスを支持する研究の方法論的な質を検証したシステマテックレビュー＋メタアナリシスです。結果として「見かけ上の改善シグナルはあるが、その証明系が脆弱である」ことを示唆しています。文献12はクローズドです。非侵襲的RFが皮膚においてどのような分子生物学的変化を引き起こすか、特にFGF2、CD105、COX-2に注目して検討しています。あわせて、加水分解コラーゲン（hydrolyzed collagen, HC）併用の影響も見ています。因果推論が過剰のようですが・・・文献13は、皮膚のリジュビネーションを目的としたRF治療に関する臨床研究21報、計354例をまとめ、fractional RFとnon-ablative RFを中心に、シワ、肌質、たるみ等の改善と一過性有害事象の概況を整理したレビューです。ただし、機器の種類、照射条件、評価指標、研究デザインの異質性が極めて大きく、定量的な一般化は困難という印象です。文献14は、韓国人女性を対象に、4 MHzのMRFを用いて眼周囲のシワ改善を検討した単群前後比較の前向き介入研究です。70名登録、66名完遂で、3回照射、最終照射4週後に画像解析でシワ面積を評価しています。対照群なし、ランダム化もなされていません。生体加熱に関する工学的記述が、例によって、水分子云々という妄言が書かれており、読むに堪えません笑“bipolar RF より深い bulk heating”bulk heatingという言葉自体、工学的に定義された用語ではなく、非定量的で以下略文献15は、2014–2020年までのRFによる顔面のリジュビネーション治療関連文献を、機器タイプ別に俯瞰、概説したナラティブレビューです。古い論文の集積ですので、温度生物学的な観点からすると単純すぎる記載となっています。少なくとも加熱反応はPennes型熱伝達で考え、組織応答は熱履歴依存量で評価すべきという現在は常識とされる視座が欠けています。文献16はabstractのみ参照可能です。monopolar RFと、1% コウジ酸を含む経皮導入システムを組み合わせた治療が、肝斑に対して有効かつ安全かを検証しています。抄録を見る限り対照群がないので以下略文献17もクローズドです。MRF（Thermage FLX）単回＋1440/1927 nm nonablative fractional diode laser を4回行い、肌質、光老化、色素異常に対する有効性を検証しています。やはり、単群介入研究です・・・文献18もクローズド。熱傷後色素沈着に対するmicro-plasma RFの有効性、安全性を検証しています。短期的には改善シグナルを示したとされていますが、対照群、ランダム化、盲検化の記載は抄録上ありません。文献19は、眼周囲色素沈着（periorbital hyperpigmentation, POH）に対するsublative fractional radiofrequency（SFR）の有効性を検証しています。POHは疾患名というより、外観の表現型で様々な病態があり、同一集団として解析するのは厳しいような気がします。これも単群介入研究です。文献20を要約すると、fractional microneedling radiofrequency（300 µm 刺入）にlow-fluence 1064 nm Q-switched Nd:YAGを追加施術することにより、加齢関連の顔面色素沈着の臨床的改善が促進され、その機序として「表皮老化細胞の減少」と「基底膜 collagen IV の回復」を提示しています。臨床＋ex vivo 機序探索のハイブリッド研究です。デザインは prospective, split-face, randomized, single-blindedで、臨床試験の被験者は、25 人のアジア人女性です。肝斑単独と日光性色素斑混合型を同枠としたり、そもそも針の深度とエネルギー沈着の深度分布は等価ではありませんので以下略文献21は、肝斑単独、あるいは肝斑にRH（rebound hyperpigmentation）を伴う症例に対して、invasive bipolar alternating current RFの有効性と安全性を検証したものです。RHの定義が明確化されておらず、また、対照群を欠く単施設後ろ向き観察研究ですので因果推論は以下略 著者は、MRFの色素改善効果を示唆する間接的な知見はあるものの、MRF 単独治療による効果を直接検証した臨床データや作用機序のデータは不足していると述べている。 プロスペクティブに収集した臨床試験データ を用いたレトロスペクティブな解析により、特に色素沈着の軽減に重点を置き、MRFによるリジュビネーション効果を包括的に評価することを目的とした。 さらに、 脱色素作用の分子機序究明のために、UVB-irradiated human skin tissue を用いた ex vivo 実験を実施した。プロスペクティブに収集した臨床試験データ を用いたレトロスペクティブな解析要は、前向きに集められた別目的データを後ろ向き再解析した、ということです。ですので、主要仮説が事後設定である可能性や選択バイアスが以下略。当該論文では、メソッド節が後置されていますが、通常の順番でご紹介いたします。メソッド 臨床試験 研究デザインと被験者 本研究の臨床パートは独立に新規設計された試験ではなく、もともと「二種類のMRF機器によるリフトアップ・シワ改善効果の評価」を目的として行われた三施設におけるsplit-face試験の一部データを、単施設で後ろ向きに再解析したものである。 本稿の解析対象は、その三施設のうち Yonsei University コホートのみに限定され、さらに「加齢に伴う色素沈着の悩み（additional age-related pigmentation concerns）」を有する症例の臨床写真と評価記録を用いて、加齢関連色素沈着の改善を評価した、という設計。 被験者は 30–65歳の26人（平均年齢57.54歳、男性3名、女性23名、Fitzpatrick II–IV）で、試験期間中に他の皮膚科的処置を控え、プロトコル遵守が可能な者を組み入れた。 除外基準は、ケロイド・肥厚性瘢痕体質、6か月以内の顔面の施術、熱誘発性の疾患（heat-induced disorders）、コントロール不良の全身状態、ハイドロキノンや トラネキサム酸等の美白剤使用歴、およびフォローアップ診察を完遂しなかった者。 倫理面では IRB 承認と Helsinki 宣言準拠、文書同意取得が記載されている。今回の hyperpigmentation 解析は、既存データを転用した二次解析ですので、色素関連アウトカムが事前に主要評価項目として規定されていたかどうかは不明です。三施設で行われた元試験から、今回 Yonsei University cohort のみをレビューした理由が書かれていません。なぜ、マルチセンターの利点を捨てて単施設抽出を行ったのか・・・age-related pigmentation concernsの定義が不明です。医師評価か、患者申告か、シミの種類は・・・nosologyが曖昧です。元試験は左右顔面で 10thermaとThermage を割付けたsplit-face designです。つまり本来は 機器間比較の研究です。ところが今回の記述では、Yonseiコホートを用いて MRF全体の加齢性色素沈着の改善効果を評価した、とされており、非治療対照群が存在しないことになります。 治療プロトコル 原則、麻酔は行わなかったが、被験者の感受性や希望に応じて局所麻酔の使用を認めた。 照射条件としては、両機器とも 6.78 MHz, max 400 W, 75–400 Ω とされ、全顔と 眼周囲領域 の双方を治療。 Thermage 群では顔面 4.0 cm² tip、10therma 群では顔面 5.0 cm² tip を使い、顔面の nominal energy density はほぼ同等に設定され、眼周囲も近似した水準に揃えた。 ショット数（全顔300、眼周囲113）、治療時間（7分30秒、5分）、皮膚表面の温度管理（38℃～42℃）は両群で同一とした。 nominal energy density 詳細は原文をご覧ください。要は、公称J/cm²を合わせたということでしょうが、顔面用チップは Thermage 4.0 cm²、10therma 5.0 cm² となっています。チップ面積が異なる時点で、電極形状、接触面積、境界条件、電場分布、return path の実効分布が変わる可能性があり、J/cm² を同一にしても、組織内 power deposition が同一にはなりません。また、皮膚表面温度と深部のthermal dose は単純に相関しませんので以下略ちなみに、10thermaのFDA 510(k) Summaryこの書面のthermageFLXとの比較表のindication(適応）部分、意図的に10therma との共通項のみ書いてあるようです。なお、ThermageFLXのFDA 510(k) Summary 皮膚パラメータの臨床測定 評価時点は、治療前（V0）、治療4週後（V1）、治療16週後（V2）の三時点。各測定時には、まず洗顔を行い、その後、温度20–24 ℃、相対湿度45–55%の管理環境下で30分間順化させた後に評価を実施。 主要評価項目 主要評価には Antera 3D CS を用いた。この装置は、制御された多方向LED光源下で皮膚画像を取得し、分光反射率解析を用いて3D表面再構築を行い、色素関連指標を客観評価すると記載されている。評価した色素関連パラメータは以下の4つ。 Melanin level 皮膚におけるメラニン色素の全体的な濃度を測定する指標。 Melanin variation (uniformity) メラニン分布の均一性を評価する指標であり、variation が高いほど色素分布が不均一であることを示す。 Melanin hyperconcentration 異常に高いメラニン密度を示す局在領域を定量化する指標。 Melanin hyperconcentration area (mm²) 上記の高色素領域の総表面積を測定する指標。 主観評価は、皮膚科認定医 N.H.N. が hemi-MASI scale(Table S1)を用いて実施。 評価は、Mark Vu™ により取得された標準化デジタル写真で行った。この装置は normal、specular、polarized、ultraviolet の複数制御LED光源下で高解像度の顔面画像を取得すると説明されている。アンテラ３Dでは、表皮メラニンと真皮メラニンの厳密な分離はできません。また、Melanin variation、 Melanin hyperconcentration は装置のアルゴリズムに依存した二次指標です。hemi-MASI は本来 melasma 評価由来のスケールですが、当該論文では、“age-related hyperpigmentation”を対象としており、他の色素性病変を含みますので、この点をどう処理しているのか・・・また、盲検化がなされているか否かは、ここでは不明です。 副次評価項目 客観指標は、いずれも Antera 3D CS を用いて定量。 Wrinkles シワは外眼角と 鼻唇溝の領域で評価した。 Indentation index シワの平均的な深さと重症度を示す指標。 Maximum wrinkle depth (mm) シワの最深部を mm 単位で測定する指標。 Pore volume 視認可能な毛孔の総体積を表し、毛孔拡大を反映する指標。 Hemoglobin Concentration 皮膚の赤みを定量する指標で、血管性変化や炎症に関連する。 Variation 測定領域内での赤み分布の均一性を評価する指標。 Texture arithmetical skin roughness (Ra) を用いて評価。Ra は皮膚表面の高さ変動の平均を表す指標であり、値が高いほど表面が粗いことを意味する。 全体的な審美性の改善に関する主観的評価として、被験者と 研究者の双方が GAIS を用いて評価した。GAIS は、ベースライン時の外観に対してどの程度改善したかを評定する尺度である(Table S2)。 各来院時に有害事象のモニタリングを行い、確認または申告されたすべての事象を記録し、安全性評価のために発生率を算出した。 臨床評価項目と評価スケジュールの要約をTable S3に示した。主解析は色素系のはずですが、primaryもsecondary も多くて、探索的ですね。他にもいろいろありますが、結果節、考察節に期待です。 EX Vivo実験 Ex Vivo皮膚組織培養およびUVB/MRF照射 残余ヒト皮膚試料は、乳房再建術を受けた 40〜50歳の健常なKorean descent女性ドナーから採取されており、Severance Hospital の IRB 承認（IRB No. 4-2025-0577）下で実施された。 研究利用に関する文書による同意は全被験者から取得し、年齢、性別、民族、組織採取部位等の詳細なドナー情報は Table S4. に示した。 皮膚組織は 3名の健常女性ドナーから取得し、各ドナーについて各条件ごとに3回 以上実験を行った。 組織は DMEM + 10% fetal bovine serum + 1% penicillin–streptomycin で培養した。 各全層皮膚サンプル は 4 × 4 cm² にトリミングし、control、UVB、UVB + MRF の3群に割り付けた。 UVB 群および UVB + MRF 群には、UV Crosslinker を用いて 30 mJ/cm² の UVB を 0、24、48 時間の3時点で照射した。 色素誘導後、UVB + MRF 群には 10thermaの 5 cm² tip（level 3.5、cooling intensity 7 ）を用いて、標準化条件下で MRF 照射が行った。 照射直後に 皮下脂肪組織を慎重に除去し、組織は complete DMEM と 5% (w/v) agar stock を 4:1 で混合して作成し、DMEM-based 1% agar gel 上に置いた。全サンプルは 37 ℃、5% CO₂、加湿インキュベーター内で5日間維持し、培地は 24時間ごとに交換した。3回 以上実験を行った。統計単位はどうなるのか？と疑問に思いますが、これは別節で回収されます。UVB + MRF 群はありますが、MRF 単独群がないようです。MRFの照射条件がほぼ何も書かれていません。熱履歴はおろか、ショット数さえ照射後、脂肪を除去したのは、その後の処置を簡便にするためで、妥当ではあるのですが、意外と様々な影響が以下略 組織学的解析 皮膚組織は 10% 中性緩衝ホルマリンで24時間固定し、その後 パラフィン包埋し、4 μm厚に切片化して FFPE標本を作製した。 染色後の切片は、CX3光学顕微鏡で観察し、さらに Axio Scan.Z7 により 200倍でデジタルスキャンして画像解析に用いた。 H&E染色は、市販のH&E 染色キットを用い、取説に従って行った。目的は、表皮および真皮の組織学的変化の評価。 FM染色では、FFPE切片に対して standard black reduction を行いメラニンを可視化し、その後 nuclear fast red で対比染色した。使用したのは Fontana–Masson 染色キット。メラニン沈着は ImageJ (version 1.46r) を用いて、表皮内における melanin-positive area の割合を算出し定量化。ImageJ で算出する melanin-positive area % は、もちろんメラニン総量そのものの直接定量ではありません。ROI設定等詳細については記載がありません。また、メラニンの定量化は表皮内のみのようですね。なお、FM染色は、eumelanin とpheomelanin の区別はできません。 免疫組織化学（IHC） FFPE切片は 脱パラフィン化、再水和の後、熱誘導エピトープ賦活化を行った。 抗原賦活化は、Target Retrieval Solution（pH 6.0）を用いて 95 ℃で20分間処理した。対象抗原は Ki-67 と チロシナーゼ（TYR）。 切片は 3% H₂O₂で10分間処理され、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制。続いて、5%正常血清 により室温で2時間ブロッキングを行い、Ki-67（1:500）および TYR（1:100）に対する一次抗体で4 ℃にて一晩インキュベーションした。 洗浄後、二次抗体処理を行い、標本は Axio Scan.Z7 により200倍でデジタルスキャンし、ヘマトキシリンで対比染色した後、ImageJ を用いて定量化した。もっとも重要な、何を数えたか、定量化したか、が書かれてないのですが・・・Ki-67は細胞増殖の指標、チロシナーゼ（TYR）は、メラニン合成の律速酵素です。 ウェスタンプロット 組織は TissueLyser II を用いてホモジナイズされ、ホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した RIPAバッファーにより総タンパクが抽出された。 タンパク濃度は bicinchoninic acid assay（BCA assay） で測定され、吸光度はマイクロプレートELISA リーダーで測定した。 各レーンに20 µg のタンパク質をロードし、8–10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を 80 V で2時間行った後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。 膜は 室温で1時間、5%脱脂粉乳入りのTBSTでロッキングされ、その後、4 ℃で一晩、以下の一次抗体とインキュベートした。MMP1（1:1000）、COL I（1:1000）、COL IV（1:1000）、GAPDH（1:1000） 洗浄後、膜は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（horseradish peroxidase-linked anti-rabbit IgG secondary antibody） と室温で1時間インキュベートした。 タンパク質バンドは強化化学発光法（ECL） により検出し、Amersham ImageQuant 800 システムで撮像した。 使用抗体の詳細は Supplementary Table S5に、定量に対応する original Western blot images はFigure S4 に示した。色々と記載の不足感はありますが以下略 RT-ｑPCR（Quantitative Reverse Transcription PCR） 組織サンプルは TissueLyser II を用いてホモジナイズし、TRIzol 試薬により総RNAを抽出した。 RNA濃度は NanoDrop 2000分光光度計を用いて評価した。 cDNA は、RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT) キットを用いて 総RNA から合成した。 RT-qPCR は Q Master Mix を使用し、QuantStudio 3 Real-Time PCR システム上で行った。PCR条件は、50 ℃で2分、95 ℃で10分の後、95 ℃ 15秒、60 ℃ 1分を 40サイクル行い、最後に 95 ℃ 15秒、60 ℃ 1分、95 ℃ 15秒延長した。プライマー配列はTable S6 に記載した。 相対 mRNA 発現量は、GAPDH を 内部対照として 2^−ΔΔCt 法で算出した。 RT-qPCR 解析には、3名の独立ドナー由来組織（生物学的反復） が用い、各サンプルは technical triplicate（３回反復）で測定した。測定対象遺伝子は、TableS6を見るとわかりますが、これだけでは不足が以下略標準的ですが、最低限のことしか書かれていない印象です。 統計解析 統計解析とグラフ作成は GraphPad Prism 10.2.2 を用いて行い、有意水準は p < 0.05 とした。結果は mean ± standard deviation で示した。 臨床試験では、正規分布データに関しては、各群内の経時変化を評価するために 一元配置反復測定ANOVA を用い、その後、各時点間の対応のある比較 について Tukey の post-hoc test を適用。 非正規分布データに対しては、各群内の経時変化を評価するために Friedman test を用い、その後の post-hoc 解析として Wilcoxon signed-rank test に Bonferroni 補正を併用。 年齢と脱色素効果の相関を評価するために、ベースライン値を共変量として調整した線形回帰分析を用いた。 RT-qPCR 実験では、2^−ΔΔCt 法で算出した相対遺伝子発現量を mean ± SD（n = 3 biological replicates） で提示した。 一方、群間差の統計解析そのものは、ΔCt 値に基づく線形混合効果モデル を用い、ドナーを ランダム効果として扱った。 さらに、多重比較に対して adjusted p-values を適用。この部分も標準的な印象ですが、そもそもこの論文は、split-face 二機種比較が中心解析要件のはず。その割には、各群内でベースライン、4週、16週を比較する方法しか書かれていないのですが（paired split-face trial に対して、本来あるべき二元的・階層的モデルが書かれていない）・・・今回はここまでとさせてください。――――――――――――――――――――――――――――――――――◆ペルラクリニック神宮前Webサイト（原宿・表参道）◆ ポリシー・診療の流れ◆ ウルセラ説明◆ ウルトラセルZi:◆ ミラドライ説明◆ XERF説明◆ 治療費一覧◆お問い合わせ◆アクセス( JR原宿駅 徒歩1分 )◆ 診療時間 10時~18時 /月・木休診（振替診療の場合もあります）◆ 美容皮膚科ペルラクリニック神宮前では、初診から治療・治療後フォローまで、院長が一貫して、お一人お一人に最適化した治療を、良心的な価格でご提案、実施いたします。◆ 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