ビワの逸話
The fruit of Japan’s Nespolo began spreading in Europe at the beginning of 1800, the first specimen being implanted in the Botanical Gardens of Paris in 1784 and later at Kew Gardens in London in 1787. Originally planted in eastern China, naturalized in Japan for about a millennium, was introduced to Europe at the end of the 18th century for ornamental purposes and for its edible fruits. Important crops for fruit production occur mainly in Spain (Alicante) and Italy (Sicily). In fact, it is naturally naturalized in much of the territory.
https://antropocene.it/en/2022/10/31/eriobotrya-japonica-en/
日本のネスポロ（ビワ）の果実は 1800 年初頭にヨーロッパに広まり始め、最初の標本は 1784 年にパリの植物園に植えられ、その後 1787 年にロンドンのキューガーデンに植えられました。
もともと中国東部原産で、約 1000 年の間に日本に帰化し、18 世紀末に観賞用と食用果実のためにヨーロッパに導入されました。
果物生産のための重要な作物は、主にスペイン (アリカンテ) とイタリア (シチリア) で生産されています。実際、ネスポロは領土の多くで自然に帰化しています。
※中国から日本には古代に持ち込まれたと考えられている。日本では江戸時代にビワの栽培が盛んになり、寺の僧侶が檀家の人々に中国から伝わったビワの葉療法を行ったため、寺にはビワの木が多いといわれている。ウイキペディア
ビワの薬効についてはご存じの方が多いはず。以下は今回の本文であるが、長文過ぎる。何とか短縮しようと検討するも・・・・・・
読んでも我らには意味のない章には「読解不要」と記入しました。
まあ、乳がんに関心のある方、或いは、乳がんの恐れのある方は、一応、目を通しておいた方が良いでしょう。
一般的には、この記事の最後の「結論として」の僅か10行の箇所のみの読解で充分と思われます。ここは青文字で然も下線を引いています。
Loquat (Eriobotrya japonica) extracts suppress the adhesion, migration and invasion of human breast cancer cell line
ビワ（Eriobotrya japonica）抽出物はヒト乳がん細胞株の接着、移動、浸潤を抑制する
Min-Sook Kim,1 Mi-Kyoung You,1 Dong-Young Rhuy,2 Yung-Jae Kim,3 Hum-Young Baek,3 and Hyeon-A Kimcorresponding author1
Abstract
We examined the inhibe. itory effects of loquat methanol extract on the adhesion, migration, invasion and matrix metalloproteinase (MMP) activities of MDA-MB-231 human breast cancer cell lin
要約
ビワメタノール抽出物がヒト乳がん細胞株 MDA-MB-231 の接着、移動、浸潤、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）（註）活性に及ぼす阻害効果を調べた。
（註）MMP
マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease；）
細胞外マトリックス成分であるコラーゲンなどの蛋白質やプロテオグリカンの分解酵素は、形態形成や血管新生に重要な働きをしている。これらマトリックス成分の分解系は、食作用により細胞内に取り込まれてから分解される系のほかに細胞外で分解される系があり、MMPという酵素群が関与している。MMPは活性中心に亜鉛をもつ金属酵素であり、MMP-1～MMP-20のアイソフォームがある。https://med.toaeiyo.co.jp/contents/cardio-terms/pathophysiology/2-90.html
Cells were cultured with DMSO or with 10, 25, or 50 µg/ml of loquat methanol extract. Both leaf and seed extracts significantly inhibited growth of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner, although leaf extract was more effective.
細胞は DMSO（《化学》ジメチルスルホキシド） または 10、25、または 50 µg/ml のビワメタノール抽出物で培養した。葉と種子の抽出物はどちらも用量依存的に MDA-MB-231（ヒト乳がん細胞株）細胞の増殖を著しく阻害したが、葉抽出物の方がより効果的であった。
Adhesion and migration were significantly inhibited by loquat extracts in a dose-dependent manner. Loquat extract also inhibited the invasion of breast cancer cells in a dose-dependent manner and leaf extract was more effective than seed extract.
ビワ抽出物は用量依存的に接着と移動を著しく阻害した。ビワ抽出物は用量依存的に乳がん細胞の浸潤も阻害し、葉抽出物は種子抽出物よりも効果的であった。
MMP-2 and MMP-9 activities were also inhibited by loquat extract. Our results indicate that methanol extracts of loquat inhibit the adhesion, migration and invasion of human breast cancer cells partially through the inhibition of MMP activity and leaf extract has more anti-metastatic effects in cell based assay than seed extract.
MMP-2（註）および MMP-9（註）活性もビワ抽出物によって阻害されました。私たちの結果は、ビワのメタノール抽出物が MMP活性の阻害を通じて部分的にヒト乳がん細胞の接着、移動、浸潤を阻害し、葉抽出物は細胞ベースのアッセイで種子抽出物よりも抗転移効果が高いことを示しています。
（註）MMP-2
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP：別名コラゲナーゼ）の一種で基底膜のIV型コラーゲンを分解する。MMPは不活性型として産生され，切断されて活性型となる．また組織内ではTIMP （tissue inhibitor of metaloprotainase）により過剰な反応が制御されている。
（註）MMP-９（マトリックスメタロプロテイナーゼ-９）
生体骨髄内の造血幹細胞の至適微小環境（ニッチ）への定着と離脱の分子制御機構は，造血系細胞の分化，動員そして増殖等の細胞動態と密接な関連性を有していることが明らかとなってきている。
近年，こうした骨髄及び骨髄由来細胞の動態において，接着分子や細胞増殖因子の細胞外ドメイン分泌を制御する。
Clinical application of loquat extract as a potent chemopreventive agent may be helpful in limiting breast cancer invasion and metastasis.
ビワ抽出物を強力な化学予防剤として臨床応用することは、乳がんの浸潤と転移を制限するのに役立つ可能性があります。
Introduction
Metastasis is a series of events including the detachment of tumor cells from the primary site, adhesion, migration and invasion of tumor cells into the blood or lymphatic vessel, extravasations out of the vessel, and interactions with the target tissues.
はじめに
転移とは、腫瘍細胞の原発部位からの剥離、腫瘍細胞の血管またはリンパ管への接着、移動、浸潤、血管からの浸潤、標的組織との相互作用を含む一連の事象です。
Motility and invasion into the new target tissue result in the formation of a secondary tumor (Song et al., 2006; Weber, 2008).
These events occur repeatedly during tumor invasion, and inhibition of adhesiveness, motility and invasiveness is likely to contribute to prevention of cancer progression (Festuccia et al., 1998; Festuccia et al., 1999; Weber, 2008).
新しい標的組織への運動性と浸潤により、二次腫瘍が形成されます (Song et al., 2006; Weber, 2008)。
これらの事象は腫瘍浸潤中に繰り返し発生し、接着性、運動性、浸潤性の抑制は癌の進行防止に寄与する可能性があります (Festuccia et al., 1998; Festuccia et al., 1999; Weber, 2008)。
These stages are determined by characteristics inherent to the tumor cells, such as hormone receptor status, production of proteolytic enzymes, expression of cell adhesion molecules and increase in motility (Kohn & Liotta, 1995; Shaikh et al., 2008), as well as by a number of growth factors, matrix molecules and cytokines in the metastatic microenvironment (Yoneda et al., 1994).
これらの段階は、ホルモン受容体の状態、タンパク質分解酵素の産生、細胞接着分子の発現、運動性の増加など、腫瘍細胞に固有の特性によって決定されます (Kohn & Liotta, 1995; Shaikh et al., 2008)。
また、転移性微小環境における多数の成長因子、マトリックス分子、サイトカインによっても決定されます (Yoneda et al., 1994)。
Matrix metalloproteinases (MMPs) promote tumor progression by degrading normal barriers (Johansson et al., 2000).
MMP-2 and MMP-9 (gelatinase A and B) are related to tumor invasion and metastasis because of their capacities for tissue remodeling via the extracellular matrix, basement membrane degradation and induction of angiogenesis (Sun et al., 2009).
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、正常なバリアを分解することで腫瘍の進行を促進します（Johansson et al., 2000）。
MMP-2 および MMP-9（ゼラチナーゼ A および B）は、細胞外マトリックス、基底膜分解、血管新生誘導による組織リモデリングの能力があるため、腫瘍の浸潤および転移に関連しています（Sun et al., 2009）。
Loquat (Eriobotrya japonica Lindley) has been used as a medicinal plant in Japan and China. Astringent leaves of loquat have been used for a long time to treat chronic bronchitis, coughs, phlegm, high fever and gastroenteric disorders.
Terpenoids isolated from loquat leaves have anti-tumor, antiviral and anti-inflammatory properties (Liang et al., 1990; Nozato et al., 1994; Shimizu et al., 1996; Tommasi et al., 1992).
ビワ（Eriobotrya japonica Lindley）は、日本と中国で薬用植物として使用されてきました。ビワの収斂性の葉は、慢性気管支炎、咳、痰、高熱、胃腸障害の治療に長年使用されてきました。
ビワの葉から単離されたテルペノイドには、抗腫瘍、抗ウイルス、抗炎症の特性がある (Liang et al., 1990; Nozato et al., 1994; Shimizu et al., 1996; Tommasi et al., 1992)。
Euscaphic acid, one of triterpene acids isolated from the methanol extract of loquat, was reported to exhibit marked anti-tumor promoting activity in an in vivo two-stage carcinogenesis test of mouse tumor (Banno et al., 2005).
Polyphenol compounds in loquat leaves are cytotoxic against human oral tumor cell lines (Ito et al., 2000). In contrast, loquat seeds have the inhibitory effect of oxidative-stress and hypoglycemic property (Kim et al., 2009). However, a little has been performed on the investigations of their pharmacological importance.
ビワのメタノール抽出物から単離されたトリテルペン酸の 1 つであるユースカフィン酸は、マウス腫瘍の in vivo 2 段階発癌試験で顕著な抗腫瘍促進活性を示したと報告されている (Banno et al., 2005)。
ビワの葉に含まれるポリフェノール化合物は、ヒトの口腔腫瘍細胞株に対して細胞毒性がある (Ito et al., 2000)。
対照的に、ビワの種子には酸化ストレスの抑制効果と低血糖特性がある (Kim et al., 2009)。しかし、その薬理学的重要性に関する研究はほとんど行われていない。
Thus, we investigated anti-metastatic effects of loquat leaf and seed extracts in this study and reported the inhibitory effects of loquat extracts on the adhesion, migration, invasion and MMP activity of MDA-MB-231 human breast cancer cells.
そこで、本研究ではビワの葉と種子の抽出物の抗転移効果を調査し、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞の接着、移動、浸潤、およびMMP活性に対するビワ抽出物の阻害効果を報告した。
Materials and Methods
Preparation of the methanol extract
Loquat leaves were collected from the Herb Garden of Mokpo National University in Muan, Korea. Leaves were freeze-dried and powdered.
Loquat seeds were collected from Wan-Do in Jeonnam, Korea and used for preparation of extract after peeling of hard shells.
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材料と方法 「読解不要」
メタノール抽出物の調製
ビワの葉は、韓国務安にある木浦国立大学のハーブガーデンから収集されました。葉は凍結乾燥され、粉末にされました。
ビワの種子は、韓国全羅南道のワンドから収集され、硬い殻を剥いた後に抽出物の調製に使用されました。
The methanol extracts were obtained by macerating leaf powder and seeds with 80% methanol for 2 days at room temperature, and this procedure was repeated twice.
The respective extract was filtered under reduced pressure and freeze-dried. The yields obtained were 32% for leaves and 27% for seeds.
メタノール抽出物は、葉の粉末と種子を80％メタノールで室温で2日間浸軟させることによって得られ、この手順は2回繰り返されました。
それぞれの抽出物は減圧下で濾過され、凍結乾燥されました。得られた収率は、葉で32％、種子で27％でした。
Cells and culture conditions
The MDA-MB-231 human breast cancer cells were obtained from the American Type Culture and Collection (Rockville, MD).
All cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, Gaithersburg), supplemented with penicillin 100units/ml, streptomycin 100 µg/ml and 10% fetal bovine serum, and incubated in a humidified incubator at 37℃ and 5% CO2. Cultures used in subsequent experiments were at < 20 passages.
細胞と培養条件 「読解不要」
MDA-MB-231 ヒト乳がん細胞は、American Type Culture and Collection（註） (Rockville, MD) から入手しました。
（註）ATCC（American Type Culture Collection）
1925年に米国に設立された世界最大の生物資源バンクです。 細胞株は3,400種以上、微生物株（酵母、カビ、原虫含む）は約72,000種類、遺伝子株は約800万種類を保存・分譲しており、世界中のバイオ研究者に広く利用されています。
すべての細胞は、ペニシリン 100 単位/ml、ストレプトマイシン 100 µg/ml、および 10% ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改良イーグル培地 (DMEM、Gibco、Gaithersburg) で培養し、加湿インキュベーターで 37℃、5% CO2 で培養しました。その後の実験で使用した培養は、20 継代未満でした。
Cell proliferation assay
To determine the effect of leaf and seed methanol extracts on MDA-MB-231 cell proliferation, cells were seeded in 6-well culture plates at a concentration of 6×104/well.
細胞増殖アッセイ「読解不要」
葉と種子のメタノール抽出物がMDA-MB-231細胞の増殖に及ぼす影響を調べるため、細胞を6ウェル培養プレートに6×104/ウェルの濃度で播種しました。
Complete medium with DMSO or with 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract were replaced every other day, beginning the day after seeding.
Cells cultured in complete medium were harvested with trypsin-EDTA on day 5 after treatment and counted by a model Z1 Coulter particle counter (Coulter Corp, Miami, Florida).
DMSOを含む完全培地、または10、25、50 µg/mlの葉または種子抽出物を含む完全培地を、播種翌日から1日おきに交換しました。
完全培地で培養した細胞は、処理後5日目にトリプシン-EDTAで採取し、モデルZ1コールター粒子カウンター（Coulter Corp、フロリダ州マイアミ）でカウントしました。
Cell adhesion assay
Plates (12-wells) were coated with 30 µg of Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA). To block nonspecific binding sites, Matrigel coated culture plates were re-hydrated with serum free DMEM containing 0.1% BSA for 90 min at 37℃ and then washed with the same medium.
細胞接着アッセイ 「読解不要」
プレート（12ウェル）を30 µgのマトリゲル（Becton Dickinson、マサチューセッツ州ベッドフォード）でコーティングしました。非特異的結合部位をブロックするため、マトリゲルでコーティングした培養プレートを、0.1% BSAを含む無血清DMEMで37℃で90分間再水和し、同じ培地で洗浄しました。
MDA-MB-231 cells were trypsinized and resuspended in serum free DMEM containing 0.1% BSA. Cells were seeded at a concentration of 2×105/well in the presence of DMSO or of 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract and incubated for 90 min at 37℃ and 5% CO2.
MDA-MB-231 細胞をトリプシン処理し、0.1% BSA を含む無血清 DMEM に再懸濁しました。細胞は、DMSO または 10、25、50 µg/ml の葉または種子抽出物の存在下で 2×105/ウェルの濃度で播種し、37℃、5% CO2 で 90 分間インキュベートしました。
At the end of 90 min, the medium was removed and the cells were washed gently two times with PBS to remove unattached cells. The attached cells were harvested by trypsinization, resuspended and counted.
Each assay was performed in triplicate and repeated in three independent experiments. Values were expressed as the average of triplicate experiment.
90 分経過後、培地を除去し、細胞を PBS で 2 回穏やかに洗浄して、付着していない細胞を取り除きました。付着した細胞はトリプシン処理により回収し、再懸濁して計数しました。
各アッセイは 3 回実施し、3 つの独立した実験で繰り返しました。値は 3 回実験の平均として表しました。
Cell migration assay
Motility was assessed using a scratch wound assay (Goodman et al., 1985). Cells were seeded into 6-well cell culture plates at a concentration of 3×105cells and cultured in 10% FBS DMEM to near confluence.
細胞移動アッセイ 「読解不要」
運動性は、スクラッチ傷アッセイ (Goodman ら、1985) を使用して評価しました。細胞は 6 ウェル細胞培養プレートに 3×105 個の細胞濃度で播種され、10% FBS DMEM でほぼコンフルエンスになるまで培養されました。
The confluent monolayer was carefully wounded using a sterile pipette tip and cellular debris was washed gently with PBS.
The wounded monolayer was incubated in 10% FBS DMEM containing 20 µg/mL fibronectin and DMSO or 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract for 24 hours. Migrating cells were examined under 10× by phase contrast microscope and photographed.
コンフルエントな単層を滅菌ピペット チップで慎重に傷つけ、細胞残骸を PBS で優しく洗浄しました。
傷つけた単層を 20 µg/mL フィブロネクチンと DMSO、または 10、25、50 µg/ml の葉または種子抽出物を含む 10% FBS DMEM で 24 時間培養しました。移動中の細胞は位相差顕微鏡で 10 倍で観察し、写真を撮りました。
Invasion assay
The ability of cells to migrate across a Matrigel barrier (invasion) was determined by a modified Boyden chamber.
浸潤分析 「読解不要」
細胞がマトリゲルバリアを越えて移動する能力（浸潤）は、改良型ボイデンチャンバーで測定しました。
Briefly, Boyden chambers were assembled using 8 µm Falcon transwell inserts (Becton Dikinson, Bedford, MA) as the upper chamber and 12-well plates as the lower chamber.
Matrigel was applied to the insert and left overnight to dry in a laminar flow fume hood. The insert was re-hydrated with serum free DMEM for 90 min at 37℃ and 5% CO2. Following rehydration, Matrigel coated inserts were washed with serum free DMEM.
簡単に言うと、ボイデンチャンバーは、上部チャンバーとして 8 µm ファルコントランスウェルインサート（ベクトンダイキンソン、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用し、下部チャンバーとして 12 ウェルプレートを使用して組み立てられました。
マトリゲルをインサートに塗布し、層流ドラフト内で一晩乾燥させました。インサートは、37℃、5% CO2 で 90 分間、無血清 DMEM で再水和されました。再水和後、マトリゲルでコーティングしたインサートは無血清 DMEM で洗浄されました。
Exponentially growing breast tumor cells were harvested by trypsin/EDTA and resuspended in 0.1% BSA DMEM. Cells were seeded at a concentration of 2×105 cells.
DMSO or 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract was carefully added to the upper chamber.
指数関数的に増殖する乳がん細胞は、トリプシン/EDTA で採取し、0.1% BSA DMEM で再懸濁しました。細胞は 2×105 個の濃度で播種されました。
DMSO または 10、25、または 50 µg/ml の葉または種子抽出物を慎重に上部チャンバーに加えました。
Twenty micrograms of fibronectin was added as a chemoattractant to the lower chamber.
The Boyden chamber was incubated for 24 hours at 37℃ and 5% CO2. At the end of incubation, the cells in the upper chamber were removed by wiping gently with a cotton swab.
Cells that transversed the Matrigel and attached to the lower surface of the insert were fixed with 10% formalin and stained with 0.5% crystal violet.
20 マイクログラムのフィブロネクチンを化学誘引物質として下部チャンバーに加えました。
ボイデンチャンバーを 37℃、5% CO2 で 24 時間インキュベートしました。インキュベーションの最後に、上部チャンバーの細胞を綿棒で軽く拭いて除去しました。
マトリゲルを横切ってインサートの下面に付着した細胞は、10% ホルマリンで固定し、0.5% クリスタルバイオレットで染色しました。
Inserts were examined under 20× or 40× phase contrast field microscopy and photographed. Values for invasion were expressed as the number of migrated cells per microscopic field.
インサートは、20 倍または 40 倍の位相差視野顕微鏡で検査し、写真を撮りました。侵入の値は、顕微鏡視野あたりの移動した細胞数として表されました。
Four fields were counted.
Each assay was performed in triplicate and repeated in three independent experiments. Values were expressed as the average of triplicate experiments.
4 つのフィールドをカウント 「読解不要」
各アッセイは 3 回実施し、3 つの独立した実験で繰り返しました。値は 3 回実施された実験の平均として表されました。
Gelatin zymography
The activity of MMP-2 and MMP-9 in the conditioned media was assayed by gelatin zymography. Briefly, MDA-MB-231 cells were seeded at a concentration of 2×105/well in 6-well plates.
ゼラチン ザイモグラフィー 「読解不要」
調整培地中の MMP-2 および MMP-9 の活性は、ゼラチン ザイモグラフィーによってアッセイされました。簡単に説明すると、MDA-MB-231 細胞を 6 ウェル プレートに 2×105/ウェルの濃度で播種しました。
After treatment with DMSO or 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract for 24 hours, the supernatants were collected and subjected to gel electrophoresis on 10% running gels containing 0.1% gelatin. The gels were washed in 2.5% Triton X-100 for 30 minutes, followed by incubation for 20 hours at 37℃ in the incubation buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 1 mM CaCl2 and 0.2% NaN3.
DMSO または 10、25、または 50 µg/ml の葉または種子抽出物で 24 時間処理した後、上清を収集し、0.1% ゼラチンを含む 10% ランニング ゲルでゲル電気泳動を行いました。ゲルを 2.5% Triton X-100 で 30 分間洗浄し、その後 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.2 M NaCl、1 mM CaCl2、0.2% NaN3 を含むインキュベーション バッファーで 37℃ で 20 時間インキュベートしました。
The gels were stained for 10 hours in 0.5% Coomassie brilliant blue, then destained with destaining solution (45% methanol and 10% acetic acid) and photographed.
ゲルを 0.5% クマシー ブリリアント ブルーで 10 時間染色し、その後脱色液 (45% メタノールと 10% 酢酸) で脱色して写真を撮りました。
Statistical analysis
Statistics were analyzed using Sigma Stat software. Results were expressed as the mean ± S.D. of three independent experiments. Comparisons were based on one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range test. A p-value < 0.05 was considered statistically significant.
統計分析 「読解不要」
統計は Sigma Stat ソフトウェアを使用して分析しました。結果は 3 つの独立した実験の平均 ± S.D. として表されました。比較は一元配置分散分析とそれに続く Duncan の多重範囲検定に基づいて行われました。p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。
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Results
Effect of loquat on the proliferation of breast cancer cells
結果
ビワの乳がん細胞の増殖に対する効果
Loquat leaf extract inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells at all concentrations and was more effective than seed extract (Fig. 1).
ビワの葉抽出物は、すべての濃度で MDA-MB-231乳がん細胞の増殖を阻害し、種子抽出物よりも効果的でした (図 1)。
Seed extract significantly inhibited proliferation at the concentrations of 25 and 50 µg/ml, but not at 10 µg/ml.
At the concentration above 100 µg/ml of loquat leaf or seed extract, the number of cells on the day 5 after treatment was decreased to less than 6×104/well, the number of cells seeded at the beginning of proliferation assay.
種子抽出物は、25 µg/ml および 50 µg/ml の濃度で増殖を著しく阻害しましたが、10 µg/ml では阻害しませんでした。
ビワの葉または種子抽出物の濃度が 100 µg/ml を超えると、処理後 5 日目に細胞数が、増殖アッセイの開始時に播種した細胞数である 6×104/ウェル未満に減少しました。
However, extracts at the concentrations of 10, 25, and 50 µg/ml inhibited the cell growth and no cytotoxicity was observed.
Thus, we used extracts at the concentrations of 10, 25, and 50 µg/ml for further investigation of anti-metastatic effect of loquat.
しかし、10、25、50 µg/ml の濃度の抽出物は細胞増殖を阻害し、細胞毒性は観察されませんでした。
そこで、ビワの抗転移効果をさらに調査するために、10、25、50 µg/ml の濃度の抽出物を使用しました。
An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is nrp-3-259-g001.jpg
Fig. 1
画像、イラストなどを含む外部ファイル。
オブジェクト名は nrp-3-259-g001.jpg です。
図 1
Effect of Eriobotrya japonica Lindley extracts on MDA-MB231 cell proliferation. Cells were seeded in 6-well culture plates at a concentration of 6×104/well.
ビワ抽出物の MDA-MB231乳がん細胞増殖に対する効果
細胞は 6 ウェル培養プレートに 6×104/ウェルの濃度で播種しました。
Complete medium with DMSO or with 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract were replaced every the other day. Cells cultured in complete medium were harvested on day 5 after treatment and were counted.
Data were expressed as mean ± SD. Stand error bars represent three independent experiments and each experiment was triplicated.
Means with the same letter are not significantly different by Duncan's multiple test (P < 0.05).
DMSO を含む完全培地、または 10、25、50 µg/ml の葉または種子抽出物を含む完全培地を 1 日おきに交換しました。完全培地で培養した細胞は、処理後 5 日目に採取し、カウントしました。
データは平均 ± SD として表しました。標準誤差バーは 3 つの独立した実験を表し、各実験は 3 回繰り返されました。
同じ文字の平均値には、Duncan の多重検定で有意差がありませんでした (P < 0.05)。
Effect of loquat on the adhesion of breast cancer cells
ビワの乳がん細胞の接着に対する効果
Loquat inhibited the adhesion of cancer cells. Leaf extracts down-regulated the binding of the cells to Matrigel and significantly inhibited adhesion of MDA-MB-231 cells in a dose dependant manner (Fig. 2).
At a concentration of 50 µg/ml, adhesion was reduced by 56% compared to the control. Seeds had a significant inhibitory effect on adhesion only at a concentration of 50 µg/ml.
ビワはがん細胞の接着を阻害しました。葉の抽出物は、細胞のマトリゲルへの結合をダウンレギュレーションし、用量依存的に MDA-MB-231 乳がん細胞の接着を有意に阻害しました (図 2)。
50 µg/ml の濃度では、対照群と比較して接着が 56% 減少しました。種子は 50 µg/ml の濃度でのみ接着に対して顕著な阻害効果を示しました。
Fig. 2
Effect of Eriobotrya japonica Lindley extracts on MDA-MB231 cell adhesion. Cells were added to matrigel coated plates and incubated for 90 min in present of DMSO or 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract. Attached cells were counted. Data were expressed as mean ± SD. Stand error bars represent three independent experiments and each experiment was triplicated. Means with the same letter are not significantly different by Duncan's multiple test (P < 0.05).
図 2
ビワ抽出物の MDA-MB231乳がん細胞接着に対する効果。細胞をマトリゲルでコーティングしたプレートに加え、DMSO または 10、25、50 µg/ml の葉または種子抽出物の存在下で 90 分間培養しました。
付着した細胞を数えました。データは平均 ± SD として表しました。標準誤差バーは 3 つの独立した実験を表し、各実験は 3 回繰り返されました。同じ文字の平均値には、ダンカンの多重検定による有意差はありません (P < 0.05)。
Effect of loquat on the migration of breast cancer cells
The effect of loquat on MDA-MB-231 cell migration was analyzed using the scratch wound assay. In the absence of loquat extract, MDA-MB-231 cells migrated along the edges of the wound and covered the wound. Significant inhibition of cell flattening and spreading was observed in the presence of loquat leaf and seed extracts (Fig. 3).
乳がん細胞の移動に対するビワの効果
MDA-MB-231乳がん細胞の移動に対するビワの効果は、スクラッチ傷アッセイを使用して分析されました。
ビワ抽出物がない場合、MDA-MB-231乳がん細胞は傷の縁に沿って移動し、傷を覆いました。
ビワの葉と種子の抽出物の存在下では、細胞の平坦化と広がりの顕著な阻害が観察されました（図3）。
※図３の画像並びに説明文省略
Effect of loquat on the invasion of breast cancer cells
We analyzed the invasion of MDA-MB-231 using a Boyden chamber model, and both leaf and seed extract dose dependently suppressed the invasion of MDA-MB-231cells (Fig. 4). Loquat leaf extract inhibited the invasion of breast cancer cells more effectively than seed extract.
ビワの乳がん細胞の浸潤に対する効果
ボイデンチャンバー（註）モデルを使用してMDA-MB-231乳がん細胞の浸潤を解析したところ、葉と種子の抽出物はどちらも用量依存的にMDA-MB-231乳がん細胞の浸潤を抑制しました（図4）。ビワの葉抽出物は、種子抽出物よりも乳がん細胞の浸潤をより効果的に阻害しました。
（註）ボイデンチャンバーは、
細胞遊走や細胞浸潤を研究するのに便利なツール。 細胞培養プレートのウェル内に設置された円筒形の細胞培養インサートで構成されている。
Fig. 4
Effect of Eriobotrya japonica Lindley extracts on MDA-MB231 cell invasion (P < 0.05). Boyden chamber was used for the invasion assay. Cells were treated with DMSO or 10, 25 or 50 µg/ml of leaf or seed extract for 24 hours during assay. Stand error bars represent three independent experiments and each experiment was triplicated. Means with the same letter are not significantly different by Ducan's multiple test (P < 0.05).
図 4
ビワ抽出物の MDA-MB231乳がん細胞浸潤に対する効果 (P < 0.05)。浸潤アッセイにはボイデン チャンバーを使用しました。
アッセイ中、細胞は DMSO または 10、25、50 µg/ml の葉または種子抽出物で 24 時間処理されました。スタンド エラー バーは 3 つの独立した実験を表し、各実験は 3 回繰り返されました。同じ文字の平均値には、Ducan の多重検定による有意差はありません (P < 0.05)。
Effect of loquat on MMP-2 and MMP-9 enzyme activities
MMP-2 および MMP-9 酵素活性に対するビワの効果
We analyzed the effect of loquat on the activities of gelatinolytic MMP-2 and MMP-9 in MDA-MB-231 breast cancer cells to determine whether the anti-invasive activity of loquat was correlated with the inhibition of MMP activity (Fig. 5).
MDA-MB-231乳がん細胞におけるゼラチン分解性 MMP-2 および MMP-9 の活性に対するビワの効果を分析し、ビワの抗浸潤活性が MMP 活性の阻害と相関しているかどうかを判断しました (図 5)。
Loquat leaf extract had an inhibitory effect on the MMP-9 activity in a dose dependent manner, and MMP-2 activity only at the concentration of 50 µg/ml. Seed extract showed an inhibitory effect on the MMP-9 activity.
ビワの葉抽出物は用量依存的に MMP-9 活性を阻害し、50 µg/ml の濃度でのみ MMP-2 活性を阻害しました。
種子抽出物は MMP-9 活性を阻害しました。
Fig. 5
Effects of Eriobotrya japonica Lindley on the activities of MMP2 and MMP9 of MDA-MB231 cells. 1: DMSO 2: seed10 µg/ml 3: seed 25 µg/ml 4: seed 50 µg/ml 5: leaves 10 µg/ml 6: leaves 25 µg/ml 7: leaves 50 µg/ml
図 5
MDA-MB231乳がん細胞の MMP2 および MMP9 活性に対するビワの効果。1: DMSO 2: 種子 10 µg/ml 3: 種子 25 µg/ml 4: 種子 50 µg/ml 5: 葉 10 µg/ml 6: 葉 25 µg/ml 7: 葉 50 µg/ml
Discussion
Breast cancer invasion is a multiple step process characterized by altered cellular adhesion, increased motility and invasion of the extracellular matrix.
考察
乳がんの浸潤は、細胞接着の変化、運動性の増加、細胞外基質への浸潤を特徴とする多段階のプロセスです。
We treated cells with loquat leaf or seed extract for 5 days to determine the effect on the proliferation of invasive estrogen receptor-negative MDA-MB-231 breast cancer cells.
Loquat leaf extract inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells more effectively than seed extract (Fig. 1).
Polyphenols of loquat were reported to have selective cytotoxicity against cancer cell lines relative to normal cells (Ito et al., 2000).
浸潤性エストロゲン受容体陰性MDA-MB-231乳がん細胞の増殖に対する効果を調べるため、ビワの葉または種子の抽出物で細胞を5日間処理しました。
ビワの葉抽出物は、種子抽出物よりも効果的にMDA-MB-231細胞の増殖を阻害しました（図1）。
ビワのポリフェノールは、正常細胞と比較してがん細胞株に対して選択的な細胞毒性があると報告されています（Ito et al., 2000）。
In the present study, we used methanol extract which was reported to have in vivo anti-tumor promoting activity (Banno et al., 2005) and used extracts at the concentrations of 10, 25, and 50 µg/ml, at which no cytotoxicity was observed.
本研究では、生体内で抗腫瘍促進活性があると報告されているメタノール抽出物（Banno et al., 2005）を使用し、細胞毒性が認められない濃度の10、25、50 µg/mlの抽出物を使用しました。
The initial invasive action of metastatic cells requires interaction between tumor cells and the extracellular matrix (ECM) (Hazan et al., 2000; Zheng et al., 1999). We observed an inhibitory effect of loquat on cancer cell attachment ability.
転移細胞の初期浸潤作用には、腫瘍細胞と細胞外マトリックス（ECM）との相互作用が必要です（Hazan et al., 2000; Zheng et al., 1999）。ビワには癌細胞の接着能力に対する阻害作用が認められました。
The inhibitory effect of loquat may be due to suppression of adhesion protein expression and/or the activity of adhesion molecules.
Results in current study indicate that, in addition to the mechanism involving increased adhesion protein expression, the activity of adhesion molecules can increase the enhanced adhesion ability in human colon cancer (Shaikh et al., 2008).
ビワの阻害作用は、接着タンパク質の発現および/または接着分子の活性の抑制によるものと考えられます。
本研究の結果は、接着タンパク質の発現増加を伴うメカニズムに加えて、接着分子の活性がヒト結腸癌における接着能力の増強を増大させる可能性があることを示しています（Shaikh et al., 2008）。
Cell migration is crucial for cancer cell invasion and metastasis (Huang et al., 2008; Kawasaki et al., 2008). We analyzed the effect of loquat on MDA-MB-231 cell migration using the scratch wound assay and observed an inhibitory effect on cancer cell migration.
Loquat leaf and seed extracts suppressed MDA-MB-231 cell migration compared to the control (Fig. 3). Antiproliferative properties can contribute to inhibitory effect on the migration (Azios & Dharmawardhane, 2005).
細胞移動は癌細胞の浸潤と転移に極めて重要です (Huang et al., 2008; Kawasaki et al., 2008)。私たちは、スクラッチ傷アッセイを使用してビワの MDA-MB-231 細胞移動に対する効果を分析し、癌細胞移動に対する阻害効果を観察しました。
ビワの葉と種子の抽出物は、対照と比較して MDA-MB-231 細胞移動を抑制しました (図 3)。抗増殖特性は、移動に対する阻害効果に寄与する可能性があります (Azios & Dharmawardhane, 2005)。
We observed inhibitory effects of loquat on the proliferation of cancer cells (Fig. 1). However, in the present study, seed extracts were less effective on the inhibition of cell proliferation than leaf extracts, whereas the inhibitory effects of seed and leaf extracts on cell migration were similar.
Azios and Dharmawardhane (2005) reported that resveratrol, a phytoestrogen present in grape skin and red wine, inhibited breast cancer cell migration by its antiproliferative and proapoptotic properties.
ビワには癌細胞の増殖を抑制する効果があることが観察されました (図 1)。しかし、本研究では、種子抽出物は葉抽出物よりも細胞増殖の抑制効果が低かったのに対し、種子抽出物と葉抽出物の細胞移動に対する抑制効果は同等でした。
Azios と Dharmawardhane (2005) は、ブドウの皮と赤ワインに含まれる植物性エストロゲンであるレスベラトロールが、抗増殖およびアポトーシス促進特性によって乳癌細胞の移動を阻害したと報告しました。
Therefore, other factors which can affect cell migration need to be investigated to explain the discordance between the effect of loquat on cell proliferation and migration.
したがって、ビワの細胞増殖と移動に対する効果の不一致を説明するには、細胞移動に影響を与える可能性のある他の要因を調査する必要があります。
A critical event in breast cancer invasion and metastasis is the invasion of cancer cells through the extracellular matrix (Meng et al., 2000).
In our Boyden chamber model, both leaf and seed extracts dramatically suppressed the invasion of MDA-MB-231cells (Fig. 4).
乳がんの浸潤と転移における重要なイベントは、細胞外マトリックスを介したがん細胞の浸潤です (Meng et al., 2000)。
ボイデンチャンバーモデルでは、葉と種子の両方の抽出物が MDA-MB-231 細胞の浸潤を劇的に抑制しました (図 4)。
Loquat leaf extract inhibited the invasion of breast cancer cells more effectively than seed extract.
To successfully penetrate the Boyden chamber, cells must successfully adhere, degrade and transverse the Matrigel coated insert (Cos et al., 1998).
Therefore, in the present study, the inhibitory effect of invasion of loquat could be explained by its inhibition of adhesion and migration.
ビワの葉抽出物は、種子抽出物よりも効果的に乳がん細胞の浸潤を抑制しました。
ボイデンチャンバーをうまく通過するには、細胞がマトリゲルでコーティングされたインサートにうまく接着、分解、横断する必要があります (Cos et al., 1998)。
したがって、本研究では、ビワの浸潤の阻害効果は、接着と移動の阻害によって説明できます。
Matrix metalloproteinases (MMPs) are crucial for degrading extracellular matrix components and promoting tumor cellular invasion in vitro and in vivo (Johansson et al., 2000).
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、細胞外マトリックス成分を分解し、in vitro（イン・ビトロ、試験管内で および in vivo（イン・ビボ、生体内で）で腫瘍細胞の浸潤を促進するために重要です（Johansson ら、2000 年）。
To determine whether the anti-invasive activity of loquat was correlated with the inhibition of gelatinolytic MMP activity, we analyzed the effect of loquat on the activities of gelatinolytic MMP-2 and MMP-9 in MDA-MB-231 breast cancer cells (Fig. 5).
Both leaf and seed extracts more effectively inhibited MMP-9 activity than MMP-2 activities. MMP-2 and MMP-9 (gelatinase A and B) are related to tumor invasion and metastasis by their capacities for tissue remodeling via extracellular matrix basement membrane degradation and angiogenesis induction.
ビワの抗浸潤活性がゼラチン分解性 MMP 活性の阻害と相関しているかどうかを判断するために、MDA-MB-231 乳がん細胞におけるゼラチン分解性 MMP-2 および MMP-9 の活性に対するビワの効果を分析しました（図 5）。
葉と種子の抽出物はどちらも、MMP-2 活性よりも MMP-9 活性を効果的に阻害しました。MMP-2 と MMP-9（ゼラチナーゼ A と B）は、細胞外マトリックス基底膜の分解と血管新生誘導による組織リモデリング能力により、腫瘍の浸潤と転移に関連しています。
Therefore, inhibitory effects of loquat on the activities of MMPs may exert to the inhibition of invasion and MMP9 is more important than MMP 2 for the inhibition of invasion.
Loquat leaf extract was more effective on the inhibition of activities of MMPs than seed extract and this inhibitory effect was correlated with inhibition of invasion in the MDA-MB-231 cells.
したがって、ビワの MMP 活性に対する阻害効果は浸潤の阻害に影響を及ぼす可能性があり、浸潤の阻害には MMP9 の方が MMP 2 よりも重要です。
ビワの葉抽出物は種子抽出物よりも MMP 活性の阻害に効果的であり、この阻害効果は MDA-MB-231 細胞における浸潤の阻害と相関していました。
In conclusion, we demonstrated that loquat extracts were effectively able to suppress invasiveness of breast cancer cells and inhibitory effects on the adhesion, migration and MMP activities are the possible mechanisms for the inhibition of invasiveness.
Loquat leaf extract was more effective than seed extract on the inhibition of proliferation, adhesion, invasion, and MMP activities in the MDA-MB-231 cells.
Our results provide a theoretical foundation for the possibility of loquat as a potential agent for the treatment of cancer metastasis.
結論として
ビワ抽出物は乳がん細胞の浸潤を効果的に抑制できること、および接着、移動、および MMP 活性に対する阻害効果が浸潤の阻害の可能性のあるメカニズムであることが示されました。
ビワの葉抽出物は、MDA-MB-231乳がん細胞における増殖、接着、浸潤、および MMP 活性の阻害に種子抽出物よりも効果的でした。
私たちの結果は、ビワが癌転移の治療薬として有望である可能性の理論的根拠を提供します。
Footnotes
This research was financially supported by the ministry of Education, Science Technology (MEST) and Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) through the Human Resource Training Project for Regional Innovation.
脚注
この研究は、地域イノベーション人材育成プロジェクトを通じて、教育科学技術省（MEST）と韓国技術振興院（KIAT）から資金援助を受けました。
References
以下参考文献省略
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※5月から7月にかけて露地物がスーパーに出てきます。
関東から西の方で庭のある方は、その実を植えておきましょう。いつの間にか芽がでてくるかも。
30cm前後に成長したら、一旦掘り起こし、根の真ん中で最も伸びている個所（芯）を切り落としてから植え直します。
こうすることでビワの木が高くなることを防ぐのです。
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がん対策：重曹（１）
重曹で乳がんなどは消える
2019-12-04
https://ameblo.jp/minaseyori/entry-12552758343.html
甘いメープルシロップとアルカリ性の重曹（ベーキングソーダ）を一緒に激しく撹拌し、後、加熱し、結合させた飲み物は、一種のトロイの木馬である。これを飲むと乳がんなどは消える。（画像はトロイの木馬）
がん対策：重曹（２）
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2019-12-15
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