「はじめに」～「考察」の仮和訳を載せておきます。なお、誤訳があるかもしれないので、原文を参照してください。
【文献紹介】長期モニタリングのための重要遊漁対象種の仔魚の同定について（豪州）
Iain M Suthers, Noah Baylis, Tony Miskiewicz, Indiana Riley, Sharon A. Appleyard (2023) Idenfication of the larvae of recreationally important fish species for long-term monitoring. Final Report to NSW Rec Fishing Trust.
その１：報告書テキスト（英文）https://ameblo.jp/husakasago/entry-12831430972.html
その２：表２と表３（英文）https://ameblo.jp/husakasago/entry-12831436183.html
その３：仔稚魚の写真（日本産種との共通種）https://ameblo.jp/husakasago/entry-12831443049.html
その４：仔稚魚の写真（つづき）https://ameblo.jp/husakasago/entry-12831469885.html
■はじめに
オーストラリアには4,500種以上の非常に多様な魚類相があり、そのうち1,000種以上がオーストラリア南部の海域に生息している。オーストラリアの成魚種の仔魚段階の大部分は、形態学的特徴を用いて科または属の分類レベルでのみ同定できる。たとえば、Neiraら (1998) による「バイブル」を使用して、私たちはイワシ類、カタクチイワシ類、サバ類、ヒラマサ類、カンパチ類、ムロアジ類、コチ類の仔魚段階を同定できると確信している。
Neiraら (1998) は、形態学的特徴と色素沈着に基づいてオーストラリアの温帯水域からの116種の海産種と8種の淡水種を含む124種の仔魚段階を同定した。Neiraら (1998) では、多くの多様な科の仔魚がまったく考慮されていないか、科内の一部の種のみが考慮されているが、それは形態学的に類似した属または科内の異なる種の仔魚を分離するのが困難であるためである。さらに、例えば、Neiraら (1998) では、アジ類の Trachurus declivis と T. novaezelandiae の仔魚を形態学的に区別すること、特に小さい仔魚や損傷した仔魚を区別することは困難な場合があり、これらは気候変動の影響を受ける可能性が高い漁業生態系にとって重要な種である。同様に、私たちは沿岸および沖合のサンプルでコチ類を同定できるとほぼ確信しているが、例えば tiger flathead, long-spine flathead, blue-spot flathead など形態学的に類似していて現在記載されていないものもある。
オーストラリアでは20世紀初頭から魚類プランクトンの調査が行われており、1910年にはポートフィリップ湾で３種が調査され、1930～50年代にはイワシ類 (Sardinops sagax) とカタクチイワシ類 (Engraulis australis) の仔魚と卵が調査された。さまざまな種の仔魚の記載は1950年代以降に行われ、1980年代にはオーストラリアの温帯海域で仔魚群集の調査が本格的に始まった (Smithら, 2018)。2014年末から2022年にかけて仔魚が定期的に採集され、ポートハッキング国立基準点（NRS）を含むオーストラリア各地の５つの国立基準点（NRS）で採集されたサンプルから仔魚が同定された。仔魚を同定する際の課題の１つは、多くの分類群を種レベルで同定できる能力を持つ科学者がほとんどいないことである。また、分類学の専門知識の喪失が進行していることを考えると、この専門知識が新世代の水産学者にまで及ぶかどうかについて不確実性が高まっている。これは、何らかのガイダンスがなければ、将来の仔魚調査の分類学的解像度が低下する可能性があることを示唆している。DNA barcoding 法は魚類プランクトンの同定を大幅に強化し (Neiraら、2015)、分類学の専門家への依存を減らす可能性がある。 しかし、大規模調査から仔魚数データを生成する場合、DNA手法は形態学的同定手法を補完する。
最近では、世界中の多くの魚類博物館が将来の参考のために、形態学的またはアルファ分類法や barcode化された標本の画像化と並行して、DNA barcode を使用して魚類やサメ類を遺伝的に確認および同定している。魚類の場合、ミトコンドリア遺伝子 COI と BOLD (Barcode of Life System) (Herbertら、2003) と呼ばれる世界規模のデータベースが遺伝的同定に使用される。COI barcoding を使用した統合分類法は現在、分類学者にとって日常的なプロセスである。
地元でポートハッキングIMOS 国立基準点で出現する可能性があり、仔魚段階での遺伝的同定から恩恵を受ける遊漁上重要な種を対象とする。以下の代表が含まれる。
コチ科 - この地域では少なくとも６種のコチ類が知られているが、仔魚は同定されていない。
• コチ属 Platycephalus fuscus (Dusky flathead) - Neiraら (1998) で同定。しかし、NRSでは遺伝的に確認されていない。
• コチ属 Platycephalus caeruleopunctatus (Bluespot flathead) - NSW州の未記載の仔魚
• コチ属 Platycephalus grandispinis (Longspine flathead) - NSW州の未記載の仔魚
• コチ属 Platycephalus richardsoni (Tiger flathead) - NSW州の未記載の仔魚
• コチ属 Platycephalus marmoratus (marbled flathead) - NSW州の未記載の仔魚
• Ambiserrula jugosa (Mud flathead) - NSW州の未記載の仔魚
• コチ属 Platycephalus fuscus ではないコチ類仔魚は、ポートハッキング NRS サンプルで定期的に見つかる。
• コチ属 Platycephalus badsenis (Sand flathead) - Jordan (2001) によってタスマニア海域から報告された仔魚
アジ科 - 複雑な科で、yellowtail kingfish の仔魚はカンパチに似ていることもある。
• マアジ属 Trachurus novaezelandiae - Neiraら (1998) で同定されたが、仔魚は遺伝的に確認されていない。
• マアジ属 Trachurus declivis - Neiraら (1998) で同定された。その卵と仔魚は冬の間シドニー沖で出現する (Neiraら, 2015：訳者注 文献リストに記載なし)。
• ブリ属 Seriola sp. - Neiraら (1998) では属としてのみ同定されている (yellowtail kingfish S. lalandi, samsonfish S. hippos またはカンパチ)。
• ギンガメアジ属 Caranx sp. - オーストラリアの未記載の仔魚
• ムロアジ属 Decapturus - オーストラリアの未記載の仔魚
• シマアジ属 Pseudocaranx georgianus - Neiraら (1998) で同定されたが、仔魚は遺伝的に確認されていない。
タカノハダイ科 - 仔魚は morwongs として認識されているが、NSW州では仔魚の形態は種として同定されていない。
• ポートハッキングサンプル中の複数の種は、red morwong (Cheilodactylus fuscus)、blue morwong (Nemadactylus douglasii)、または jackass morwong (Nemadactylus macroptera) であると想定されることが Neiraら (1998) によって同定されたが、仔魚は遺伝的に確認されていない。
カワハギ科 - 仔魚はレザージャケットとして認識されているが、仔魚の形態は種が不明である。
ベラ科 - 仔魚はベラと認識されているが、仔魚の形態は種が不明である。
• Blue groper (Achoerodus viridis) および他の多くのベラ
メバル科（フサカサゴ科 Scorpaenidae） - 仔魚はカサゴ類として認識されているが、大部分は種が不明である。
• Neiraら (1998) で同定された ocean perch (ユメカサゴ属 Helicolenus percoides) の仔魚であるが、仔魚は遺伝的に確認されていない。
ハタ科 - 仔魚はハタや rockcod と認識されているが、仔魚の形態は種が不明である。
サバ科
• Scomber australicus - Neiraら (1998) で同定されたblue mackerel (slimy mackeral)
• 特に North Stradbroke 島 NRS で採取された他の種のサバ類またはマグロ類
ボラ科
• サンプル中に複数種のボラ類（ボラ、sand (Myxus elongatus)、flat tail (Gracilimugil argentea)）が含まれている可能性がある。
この研究の目的は次のとおりであった。
1) ポートハッキング監視定点からの形態学的に同定された仔魚を写真撮影および/または描画する。
2) ポートハッキング沖の仔魚の DNA barcoding を使用して、遊漁上重要な60種以上の仔魚 (遊漁対象ではない類似種を含む) の種の同定を、それぞれ最大４種類の異なるサイズで遺伝的に同定および/または確認する (100ｍおよび50ｍの等深線で);
3) Neiraら（1998）の最新の補足として、オーストラリア博物館に適切に保管されている標本とともに、元の図と新しい写真および確認された同定情報が並べられている文書レポートを作成する。
■方 法
■■barcoding 用仔魚の選択
COI barcoding 用の仔魚を選択するための主な要件は、仔魚が最初に野外で95％エタノール中で固定されていることである。選択の他の基準は、各仔魚の状態と、さまざまな分類群のサイズ範囲の個体が利用可能かどうかであった。研究の焦点は、ポートハッキング定点にある IMOS- National Reference Station (NRS) サンプリング定点からのサンプルであった。しかし、NSW州に生息する遊漁および商業的に重要な種の多くは、オーストラリアの東海岸に沿って分布している。したがって、barcode化される分類群の範囲と対象となる個々の分類群のサイズ範囲を広げるため、ノース ストラドブローク島およびマリア島 NRS で収集されたサンプル (表 1、サンプルの詳細は以下) および仔魚からエタノール固定仔魚が選択された。 ポートフィリップ湾で収集された魚のサンプル（Forbertら、2019）および RV Investigator で NSW州北部の海域で収集されたサンプル（Garciaら、2022）。
実験室では、実体顕微鏡を使ってサンプルを選別し、仔魚を最初のエタノールまたはホルマリン溶液から、最初にホルマリン固定されたサンプルの場合は70％エタノールに移し、エタノール固定サンプルは80％エタノール溶液に移した。DNA barcoding を容易にするために -20℃で保存した (Appleyardら、2021)。barcoding のために選択された仔魚は、barcoding のため１つの眼球を抽出する前に、オーストラリア博物館のライカ Z スタッキング顕微鏡を使用して写真撮影された。
■■Study region and IMOS sampling program
統合海洋観測システム (IMOS) は、オーストラリア各地のいくつかの国立基準点 (NRS) で海洋学、気候、生物学的データを監視する国家海洋観測プログラムである (Lynchら、2014)。この研究で使用された仔魚は、IMOS 仔魚モニタリング プログラム (IMOSLFMP) に基づく３つの NRS サンプリング サイトから調達された。すなわち、クイーンズランド州ブリスベン近郊のノース ストラドブローク島 (南緯 27.35 度、東経 153.56 度)、NSW州シドニー近郊のポートハッキング、タスマニア州ホバート近くのマリア島 (南緯 34.12 度、東経 151.23 度) とタスマニア州ホバート近くのマリア島 (南緯 42.56 度、東経 148.22 度) である。この地域は東オーストラリア海流 (EAC) の南極方向の流れが支配的で、サンゴ海から南の海域まで熱帯地域から暖かい貧栄養海水を運ぶ（Okeら、2019）。
■■Ichthyoplankton sampling at three east coast NRS
サンプルは、2014年９月から2021年12月までの７年間、３つのNRSでほぼ毎月の間隔で採集された。毎月２つの曳航サンプルが各NRSで収集され、エタノールまたはホルマリンのいずれかで保存された。2014年から2018年までは、直径85cm、メッシュ500μm のリングネット、または75×75cmの正方形のネット500μm を使用して曳網採集した。2019年から、これらのネットは、同様の総開口面積を有し同じメッシュを有する直径60cmのボンゴネット（メッシュ500μm）に換えられた。網は水深25ｍで約３ノット (毎秒1.5メートル) で約12分間曳航された。網にはゼネラル・オーシャニクスまたはTSK流量計が装備され、ろ過された水の量を測定し、その後、仔魚の存在量の標準化を可能にした。網の深さは可能な限りHOBO深度ロガーで監視した。サンプルをネットから収集し、COI barcoding 用の95％エタノールまたは４％ (中性緩衝) ホルマリンで固定した。
■■DNAextraction and COI barcoding
ほとんどの仔魚では、眼球が摘出され、個々の96のマイクロPlate のウェルに配置された。仔魚が小さすぎて眼球を摘出できない場合は、標本全体をPlate ウェルに入れた。マイクロPlate はストリップキャップで密封され、ホバートのCSIRO海洋研究所に送られ、そこでPlate はDNA抽出まで-20℃で凍結された。DNA抽出は、成魚組織に使用されるもの (Appleyardら、2018; 2021 を参照) の 1/5 の体積削減に基づいた、改良された少量の Wizard® SV ゲノムDNA精製システム (Promega、オーストラリア) を使用して行われた。 抽出は96ウェルPlate で行われ、各ウェルの総容量は200μlでした。Plate には常にストリップキャップをかぶせた。DNAを 4℃で一晩保存し、各DNAのサブアリコートを Nanodrop 8000 (Thermofisher、USA) で定量した。Plate からのDNAのアリコートも、CSIRO 海洋研究所で -80℃で保管された。
DNAのアリコートは Ramacioti Centre for Genomics (ニューウェールズ大学、シドニー) に送られ、そこで PCR 増幅と COI サンガー配列決定 (BCL および BCH プライマーを使用) (Baldwinら, 2009) が行われた。抽出されたサンプルの結果として得られたフォワード COI シーケンスとリバース COI シーケンスは CSIRO に送信され、そこでフォワード シーケンスとリバース シーケンスがトリミングされ、de novo アセンブルされ、アセンブリの塩基対呼び出し精度が手動で目視でチェックされ、Geneious Prime® 2021.2 を使用してコンセンサス シーケンスに変換された。 2 (Biomaters Ltd、ニュージーランド)。
次に、コンセンサス配列を、国際的な Barcode of Life Data System (BOLD) (生物多様性ゲノミクスセンター、カナダ) で利用可能な配列と比較した。結果は表にまとめられ、観察された既知の配列の類似性に基づいて、>98% のペアごとの同一性レベルで正しい種の一致が示された。この種の出現はオーストラリア動物相リストでも確認されている。種および属ごとに複数の仔魚サンプルの同一性が必要な場合は、分類群の確認に遺伝的 UPGMA ツリー (例として図 1 を参照) も使用された。結果に基づいて、遺伝的種の同定が各サンプルに割り当てられ、遺伝的同定が各標本の形態と照らし合わせてチェックされた。シーケンスに成功したサンプル、仔魚画像、およびそれらのメタデータは、一般にアクセス可能なプロジェクト FIMOS IMOS Australian Larval Fish Monitoring に BOLD に送信される。
図１ 既知のミトコンドリア COI に関連して、未知の仔魚 (NSW Rec. Fishing Trust の 95 ウェル Plate のウェル番号) からの異なる属と種の３つのグループ分けを示すアジ類仔魚（アジ科) のコンセンサス ツリー図の例。 BOLD の成魚 Trachurus novaezelandiae、T. declivis、Decapturus russelli の配列。
■結 果
４つの各Plate について COI barcoding の結果を表２に示す。Plate 1 、2、4 のシーケンスの成功率は高かったのに対し、Plate 3 のサンプルの３分の２はシーケンスに成功した。COI barcoding を使用して、39科90分類群の大多数の仔魚を同定した (表３)。４枚のPlate 内の多様な科は、コチ科 (9 種)、アジ科 (11 種)、およびカワハギ科 (9 種) の仔魚であった。
表１: ３つの NRS ステーションで確認されたコチ仔魚分類群の概要。総存在量と 100 m3 あたりの平均密度を示す。
Plate 1 および Plate ２: DNAbarcoding の前に、Plate 内の190個体の仔魚が、科から種まで異なるレベルで形態学的に同定された (例: イカナゴ科; Platycepalus caeruleopunctatus)。DNA barcoding により、Ambiserrula jugosa, Onigocia pedimacula, Platycephalus bassensis, Platycephalus caeruleopunctatus, Platycephalus endrachtensis, Platycephalus fuscus, Platycephalus grandispinis, Rogadius mcgroutheri, Sorsogona tuberculata and Ratabulus diversidens が同定された (表１)。
これら２枚のPlate で同定された他の科には、サイウオ科、アジ科、タカノハダイ科、シイラ科、クロタチカマス科、カワハギ科、F. ボラ科およびサバ科が含まれていた。Plate 1 では、95個体のサンプル (小さな魚の仔魚全体または仔魚の眼球からなる) のうち85個体が遺伝的にbarcode化および同定され、Plate ２の91個体のサンプルはbarcode化に成功した。
Plate 3 については95個体のサンプルのうち64個体のbarcode化に成功した。31個体のサンプルは入力されたDNAが非常に少なく、増幅されなかったため、barcode化できなかった。10科の代表が同定され、Plate にはアジ科の32個体が示されている。これには、ギンガメアジ、インドマルアジ、Pseudocaranx georgianus、Trachurus declivis、T. novaezelandiae が含まれる。
Plate 4 では、94/95個体 (99％) について非常に良好な配列決定が行われたが、４個体の仔魚については ウバウオ科の科レベルへの形態学的同定は barcode 結果によって裏付けられなかった。25科の代表が同定され、それらには silver dory (Cyttus australis)、blue warehou (Seriolella brama)、blue groper (Acherodus viridis)、leatherjacket (Acanthaluteres spilomelanurus) の仔魚が含まれていた。
■考 察
これまで、オーストラリア南部の約1,000種の魚（仔魚段階）のうち、顕微鏡で（形態学的に）種を同定できたのはわずか10％のみであり、残りの約90％は科または属にのみ分類できた (Neiraら、1998)。さらに、これらの既知の種であっても、特に孵化したばかりの仔魚については、混同されている可能性のある科または属の他のメンバーが存在するため、不確実性があった。したがって、正確な同定ツールを導入しない限り、産卵分布や沿岸流、風、気候体制が稚魚の供給に及ぼす影響を正確に理解することはできない（Schillingら、2022）。
伝統的な仔魚の形態学とDNA barcoding を組み合わせたこの研究により、仔魚を同定できるオーストラリアの種の数がほぼ 2 倍になり、現在の (形態学的) 理解が適切であることが確認された (Neiraら (1998))。特に、この研究は、私たちの地域にとって重要な魚類の３つの科、すなわち trevallies と scads (アジ科) ; コチ類（コチ科）と leatherjackets（カワハギ科）の分類学的問題を解決する。 同定された種の多くは仔魚段階では記載されていなかったため、コチ科とアジ科の種レベルの診断は特に遊漁的および分類学的に興味深いものである。
コチ類については、オーストラリア東部沖合における繁殖と空間分布の季節性が明らかになった。
A. jugosa、O.pedimacula、P. caeruleopunctatus、P. endrachtensis、P. grandispinis、P. richardsoni、R. mcgroutheri、S. tuberculata および Ratabulus 属の代表的な仔魚の特徴が、Jordan (2001) による P. badsensis および Neiraら（1998）による P. fuscusについての既存の記載に付随して、初めて詳細に記載された。 合計 2,563 個体のコチ類の仔魚から、これらの 98％が種の同定に成功し、残りの大部分が Ratabulus spp. として同定された。コチ類の産卵習性と季節性にはいくつかの違いが観察され、仔魚の個体数の違いは水温の季節変動に大きく関係していた。コチ類仔魚の種の多様性は、ノース・ストラドブローク島沖合に存在する6属7種から、ポートハッキングでの2属5種、マリア島でのマゴチ属2種へと、緯度が上がるにつれて減少した。このコチ類仔魚の同定は、気候変動や乱獲の影響の管理や修復のために情報提供することにより、よりターゲットを絞った種固有の資源評価と管理の選択肢を可能にするであろう。
我々の遺伝的 (COI) barcoding は、形態学的に類似したscads and trevally（アジ科マアジ属、ムロアジ属、シマアジ属仔魚など) を属および種レベルで分離した。これらの仔魚の多くは、当初、形態的特徴に基づいて誤って分類されていた。ポートハッキングからは、Jack mackerel (マアジ属 Trachurus declivis)、Yellowtail horse mackerel (マアジ属 Trachurus novaezelandiae)、Silver Trevally (シマアジ属 Pseudocaranx georgianus)、Yellowtail kingfish (ヒラマサ類 Seriola lalandi) のアジ科の4種が確認された。ノース・ストラドブローク島NRSでは、サバ類と Yellowtail kingfish の両種、さらに Indian scad（インドマルアジ）と Shortfin scad（モロ）も確認された。これらのムロアジ属の種は両方とも仔魚段階では記載されておらず、初期の形態学的同定ではマアジ属 Trachurus と混同された。
この研究は、ノース・ストラドブローク島沖で発見された高密度のマグロ類の仔魚に関する我々の研究を補完するものであり、仔魚の大部分がマルソウダであり、少数のヒラソウダが形態学と COI barcoding によって解決された（Cao らが準備中)。また、オーストラリア東部沖合で、カマスサワラ, ホソカツオ Allothunnus fallai, マルソウダ, ヒラソウダ, スマ, カツオ, Sarda australis (Australian bonito), キハダ、コシナガの同定と存在を確認した。
この知識があれば、より多くの温帯オーストラリア産魚の繁殖における季節的および長期的な変化を調べることができるので、このプロジェクトは興味深いものである。私たちは、2014～2022年にかけてオーストラリア各地の５つの国立基準点でIMOSによって収集されたものも含め、オーストラリア博物館で保管されている仔魚のサンプルを再検査できるようになった。
このプロジェクトは、DNA barcoding を使用した魚の繁殖モニタリングの将来を支えるものでもあるため、エキサイティングである。Barcode of Life Database (BOLD) の情報の増加は現在の同定をサポートし、多くの専門家の引退による現在の分類学の危機を一変させた。ミトコンドリア COI (例: Goldら、2021, 2023; Appleyard pers. comm.) のような特定の遺伝子の固有配列の存在について、プランクトン曳網のエタノール保存標本を検査することが現在では技術的に可能である 。さらに、我々は現在、日常的なホルマリン保存で最長６ヶ月のホルマリン保存仔魚から、COI 配列を取得することができ（Appleyardら、2021）、重大な技術的障害を克服している。