神経新生はやっぱり重要？

Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.

Sahay A, Scobie KN, Hill AS, O'Carroll CM, Kheirbek MA, Burghardt NS, Fenton AA, Dranovsky A, Hen R.

Nature. 2011 Apr 28;472(7344):466-70. Epub 2011 Apr 3.

少し時間に余裕が出たので、気になっていた論文を読みました。

脳深くにある海馬の歯状回と呼ばれる領域は、記憶などの認知機能や気分 (mood) に重要だと言われています。
より詳細には、入力情報の分離（pattern separation）を行っているらしい。入力情報の分離とは、二つの入力の違いをより大きくして、二つの情報をきちんと区別できるようにすることらしい。
また、この領域は大人になっても新しく神経細胞ができる（神経新生が起きる）場所としても知られています。
この神経新生を阻害することで、入力情報の分離がうまくいかなくなったり、抗うつ薬の効果のいくつかがなくなることから、歯状回での神経新生は認知機能や気分の制御に重要だと考えられていました。
しかしながら、神経新生が十分条件かどうか、つまり、歯状回の神経新生を促進するだけで認知能が向上するかどうかについては、良いテクニックがなかったために明らかになっていませんでした。

筆者らは、大人で新生された神経細胞の60-80%が死んでしまうことに注目しました。
（Nestin-CreERを使って成体の神経幹細胞でBaxをノックアウトすることで、）この細胞死を抑制するシステムを作ったところ、新生神経の数を約３倍まで増やすことに成功しました。
こうして生き延びさせた神経細胞は通常の細胞と同様のパターンの樹状突起や軸索を持っており、LTPも正常に起こったことから、これらは“まともな”神経細胞であることが示されました。

この新生神経細胞が増えたマウスは、記憶力やかなり異なった文脈を区別する能力は野生型のそれとほとんど同じレベルでした。
そこで、よく似た文脈の記憶を区別する能力を調べるために、恐怖条件付け学習を行い、よく似た状況をどれだけ区別して覚えていられるかを調べたところ、新生神経細胞が増えたマウスは野生型よりも良い成績を示しました。
また、抗うつ薬の効果との関連から、新規探索行動や不安行動についても調べましたが、野生型と有意な差は認められませんでした。つまり、抗うつ薬の効果に神経新生は必要ではあるものの、十分ではないことが示唆されたわけです。
面白いことに、自発運動をさせてやると、神経新生を増やしたマウスでは野生型よりも新規探索行動や不安行動が増えることから、神経新生と外的要因の両方が揃うことが重要であるようです。

やっぱり神経新生は大事ではあるんですが、万能というわけではないようですね。
専門分野から離れるんで、業界としてこのことが驚きなのかみんな思っていたことが確認されたということなのかは分かりませんが、やっぱりきちんと実験系を作ること（この場合は新生神経細胞を増やしたマウスを作ったこと）は大事なんだなと思いました。

BWAとSAMtoolsを用いたSNPとIndel/Insertionの同定

120412. 修正版の方法をアップしました。コチラのエントリーをご参照ください。

自分のサンプルのデータが出たので、ここ一週間ほどデータと格闘していましたが、ようやく使い物になるパイプラインができたので、以下にまとめておきます。
目的は、ある変異体たちの原因遺伝子を見つけることで、２つの変異体系統のショウジョウバエのゲノムをIlluminaの機械で読んで、それらを比較しました。（あんまり細かく書くと問題になるかもしれないんで、ぼかしています。ご了承ください。）結論から言うと、最初にMAQで解析を行ったのですが、私のサンプルではうまくいきませんでした。（正確には、従来のサンガー法で確認していた1塩基の欠失を検出できなかった。）もちろんオプションを検討しなおせばうまくいくかもしれませんが、面倒なのでBWAに乗り換えました。
さて、行った手順は以下の通りです。

BWAでの解析は以前のエントリーと重複しますが、一連の流れを確認するために書いておきます。

まず、SAMtoolsのバージョンがUbuntuのapt-getで手に入るバージョンに比べてかなり新しくなっているので、SAMtoolsのサイトからダウンロードし、makeしておきます（この件についてははWOLF EARSさんのサイトが詳しいです）。


① リードデータをsolexa形式からsanger形式に変換する。
maq sol2sanger in.txt out.fastq
追記: Illumina GA2の新しいデータではこの変換は不要のようです。
http://cell-innovation.nig.ac.jp/wiki/tiki-index.php?page=Illumina+GA+qualityValue%E3%81%AB%E3%81%A4%E3%81%84%E3%81%A6


② 2000000 read ごとにfastq fileを分割する。
maq fastq2bfq -n 2000000 in.fastq out.bfq
としてファイルを分割し、bfqファイルすべてに対して以下のコマンドでfastqに戻す。
maq bfq2fastq in@XXX.bfq out@XXX.fastq


③ ゲノムデータの索引（インデックス）を作る
bwa index in_genome.fasta

④ （分割した）fastqファイルをreferenceにアライメント
bwa aln in_genome.fasta in_reads.fastq > out.sai

⑤ マッピングファイルであるSAMファイルの作成
bwa sampe in_genome.fasta in_read1.sai in_read2.sai in_read1.fastq in_read2.fastq > out.sam
注: read1とread2はファイルを対応させる。

⑥ SAMファイルをBAMファイルに変換
./samtools view -Sb in.sam > out.bam
注: 普通にsamtoolsと打つとUbuntuにインストールされている古いバージョンが使われてしまうので、ダウンロードしたフォルダのアドレス/./samtools
④-⑥は分割したすべてのfastqファイルについて行います。

⑦ BAMファイルをひとつにまとめる。
./samtools merge out.bam in1.bam in2.bam in3.bam ..........

⑧ bamファイルをsortする。
./samtools sort in.bam out_sorted

⑨ 多型を抽出する。
../samtools mpileup -ugf in_genome.fasta in_sorted.bam | ./bcftools view -bvcg - > out_raw.vcf
もしくは、
./samtools mpileup -Bugf in_genome.fasta in_sorted.bam | ./bcftools view -bvcg - > out_raw.vcf

（私の目的にはとにかくfalse positiveは多くなってもfalse negativeを減らしたほうがよいので、base alignment
qualityを計算しないように-B optionもつけました。）

⑩ 多型をフィルターにかける
./bcftools view in_raw.vcf | ./vcftools.pl varFilter -D XXX > out_flt.vcf
注:ここで、varFilterの-Dオプションは（PCR時の偏りなどを除くために？）最大のdepthを指定しますので、平均リード数が多い場合は-D 1000とかにしないと目的のSNPやindelがここでなくなってしまう危険があります。（./vcftools.plとしてhelpを見ると、私のバージョンではdefaultで-D 10000となっているようです。）

以上でSNPやIndelの候補が出たので、私の場合は、
⑪ それぞれの系統のSNPリストを比較して共通のSNPを除く。
⑫ CDS内にある多型のみを抽出する。
⑬ SNPについてはアミノ酸置換かどうかを、IndelやInsertionについてはframe shiftかどうかを判定する。
という解析を行い、それぞれの変異体の原因変異の候補を同定しました。
⑪-⑬は自分でプログラムを書きました。
２つの変異体のうちの１つはすでにある遺伝子に1塩基の欠失があることがわかっており、この解析でもその変異を同定することができたので、とりあえずは目標を達成できそうです。


追記: BWAはver0.5.7を、SAMtoolsはver0.1.12aを用いました。
追記2: 結局まだfalse positiveが多かったので、⑩ではさらにawk '$6>=XX（数字）'として、base qualityでフィルターをかけました。

一週間

地震から一週間経ちました。
被災された方々に心よりお見舞い申し上げます。
私は、祖父母を初めとして親戚の多くが茨城在住でしたが、何とか全員の無事を確認でき、ほっとしています。

研究機関も東北大学を始めとして多くの機関が被害を受け、各地の学会が中止になっています。
基礎生物学研究所 では、いち早く実験場世の提供や実験動物の一時的な受け入れを表明されています。
また、（まだHPには出ていませんが、）京都工業繊維大学のショウジョウバエ遺伝資源研究センター でも、ショウジョウバエ系統の一時的な避難を受け付けるそうです。
他の研究機関でも今後同様の措置がとられると思いますので、各研究機関のHPなどをご確認ください。


一週間経ったものの、福島の原発の問題や、援助物資の輸送の遅れなど心配な状況が続いています。
政府やマスコミに対して言いたいことは山ほどありますが、それを言ってもどうにもなりませんよね。
募金や援助物資の寄付など自分にできることをした上で、できるだけいつも通り生活していくべきだと思います。

自分にやれることの一つとして、ペースは遅いかもしれませんが、ブログのエントリーを再開していくつもりです。

できるだけ早く、皆様に笑顔が戻ることを祈っております。