Annals of Pharmacology and Pharmaceutics Remedy Publications LLC.
薬理学年鑑と薬理学救済出版物 合同会社
Inhibition of the Binding of Variants of SARS-CoV-2 Coronavirus Spike Protein to a Human Receptor by Chlorine Dioxide
二酸化塩素によるSARS-CoV-2コロナウイルスのスパイク蛋白質の変異体のヒト受容体への結合の阻害
1
2021年｜第6巻｜第1号｜第1199条 はじめに コロナウイルス病2019（COVID-19）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされ、2019年後半に出現して以来、深刻な健康問題となっています[1,2]。
本症の発生は、中国湖北省武漢に端を発し、その後、世界中に急速に広がっていきました[2]。
COVID-19パンデミックは、2020年に国際緊急事態として宣言されました[3]。
2021年5月現在、COVID-19による世界の死亡者数は約330万人と推定されています[4]。
SARS-CoV-2はエンベロープ型のウイルスで、29.9キロベースの一本鎖のネガティブセンスRNAのゲノムを持っています[5]。
このウイルスは，I型およびII型の肺細胞，内皮細胞，繊毛状の気管支上皮細胞の宿主細胞表面に付着する[6]。
この病気に対するいくつかのワクチンがすでに開発され、投与されていますが [7],
パンデミックはまだ終わっていません。
さらに、現在、イギリス（B.1.1.7亜種）と南アフリカ（B.1.351亜種）から、オリジナルのウイルスよりも容易に拡散すると思われるSARS-CoV-2ウイルスの亜種が報告されています[8]。
これらの亜種はいずれも、スパイクタンパク質（Sタンパク質）の受容体結合ドメイン（RBD）に共通の変異（N501Y）を持っています[5]。
この変異は、スパイクタンパクが、カルボキシペプチダーゼ活性を持つI型膜貫通型糖タンパク質であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）というヒト細胞表面の受容体に結合する際に重要な役割を果たします[5]。
COVID-19の蔓延を抑制するためには，新規の抗ウイルス剤やワクチンと並んで，このウイルスに対する安全かつ有効な消毒剤を開発し，展開することが不可欠である[8]．
エタノールはウイルスに有効であることが知られていますが [9],
空気中に存在するウイルスを根絶することはできません。
二酸化塩素（ClO2）（CD）は、室温では水溶性の黄色い気体で、安定したフリーラジカルである[10]。
CDは、ガスまたは水溶液として、ウイルスと細菌の両方を不活性化するために使用することができます[11-15]。
CDの微生物に対する強力な殺菌作用は、タンパク質に対する強い酸化活性によるものである[16]。
二酸化塩素によるSARS-CoV-2 Coronavirus Spike Proteinの変異体のヒト受容体への結合の阻害については，よく知られている。
連絡先
619-0237 京都府精華町光台1-2-1
大幸薬品株式会社 研究開発部 緒方典夫
受信 : 2021年5月21日
受入 : 2021年6月16日
掲載 : 2021年6月18日
引用 :
二酸化塩素によるSARS-CoV-2コロナウイルスのスパイクタンパク質の変異体のヒト受容体への結合の阻害
Ann Pharmacol Pharm. 2021; 6(1): 1199.
Copyright © 2021 Norio Ogata.
本論文はCreative Commons Attribution Licenseに基づいて配布されたオープンアクセス論文であり、原著論文が適切に引用されていることを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、および複製が許可されています。
Research Article Published: 18 Jun, 2021 Abstract
目的：
新型コロナウイルスSARS-CoV-2に起因するCOVID-19は、現在進行形で世界的なパンデミックとなっている。
このウイルスから住民を守るためには、安全で強力な殺ウイルス性の消毒システムが緊急に必要である。
二酸化塩素（ClO2）は、ウイルスと細菌の両方を不活性化することが知られている強力な消毒剤である。
本研究の目的は、二酸化塩素が、変種コロナウイルス（イギリスと南アフリカの変種）のスパイクタンパク質（Sタンパク質）の受容体結合ドメインと、ヒトの受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合を阻害するかどうかを調べることであった。
材料と方法 精製したスパイクタンパク質の受容体結合ドメインとACE2との結合を調べるin vitro実験を，様々な濃度の二酸化塩素の存在下で行った。
イギリスと南アフリカの変種から精製したスパイクタンパク質を使用した。
マイクロタイタープレートにコートしたスパイクタンパクを二酸化塩素水溶液または二酸化塩素スプレー液で処理した。
結果：
変異体スパイクタンパク質の結合は、濃度依存的に阻害された
（50％阻害濃度（IC50）は、英国変異体が7.6μmol/L、南アフリカ変異体が5.8μmol/L）。
結論
以上の結果から，
二酸化塩素水溶液は，
変異型スパイク蛋白質とヒトACE2受容体蛋白質との結合を不活性化することができ，
この戦略が変異型SARS-CoV-2ウイルスの感染を阻止するのに有用であることが示された。
キーワード
二酸化塩素;COVID-19;SARS-CoV-2;ウイルス;消毒;IC50 緒方則夫*、
三浦孝則 大幸薬品株式会社 研究開発部 緒方則夫、他 Annals of Pharmacology and Pharmaceutics Remedy Publications LLC. 2 2021｜第6巻｜第1号｜記事1199 [17].
ここでは，CD水溶液がin vitroの実験で，イギリスと南アフリカの両変種のスパイクタンパク質とヒトACE2との結合を不活性化することを示し，SARS-CoV-2ウイルスの感染を抑制する効果があることを示唆している。
材料と方法 化学物質 前述のように当研究室で調製したCD [16], を精製水に溶解し，密栓した琥珀色の瓶に入れて4ºCで保存した。
ストックCDは，使用する直前に精製水で目的の濃度に希釈した。
また，「クレベリン」という商品名で販売されている市販のCDスプレー液（大幸薬品，大阪）も試した。
クレベリンの組成は，
1.48 mmol/LのCD，66.34 mmol/Lの亜塩素酸ナトリウム，
8.70 mmol/Lのリン酸二水素ナトリウム，
0.24 %（重量/重量）のモノラウリン酸デカグリセロール，
0.06 %のシリコーン，
98.97 %の水で，pH6.01であった。
3年前に製造したスプレー液を、室温で遮光した密栓ボトルに入れて使用した。
実験時のスプレー液のCD濃度は1.80mmol/L（121ppm（重量/重量））であった。
スプレー液は実験の直前に必要に応じて精製水で希釈した。
結合アッセイ スパイク蛋白質結合アッセイキットは，
BPS Bioscience社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。
英国および南アフリカのバリアントアッセイのキットコードは、それぞれ78140および78151であった。
このキットは，対応する変異型ウイルスに由来するスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）を精製したものであった。
このキットは，メーカーが推奨する方法で使用されたが，いくつかの変更が加えられた。
キットに含まれるスパイクタンパク質RBDは，マニュアルに記載されている通り，まず96ウェルのマイクロタイタープレートにコーティングした。
適切な濃度に希釈したCDまたはCDスプレー液の50μLのアリコートを各ウェルに入れ、25℃で5分間インキュベートした。
次に、キットに付属のブロッキングバッファー2に含まれる10 mmol/L チオ硫酸ナトリウムを各ウェルに20 μLずつ加え、CDとタンパク質の反応を終了させました。
この条件では，CDは速やかにClO2-に変換され，タンパク質と反応しなくなる[16]。
次に，ブロッキングバッファー2で1.5 µg/mLに希釈したビオチン標識ACE2の35 µLアリコートを各ウェルに加えた。
その後、ビオチン標識ACE2をストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させ、キットに付属の西洋ワサビペルオキシダーゼの基質を用いて検出しました。
1分後にルミノメーター（モデルSH-9000；コロナ電気、茨城県ひたちなか市）を用いてケミルミネッセンスシグナルを測定した。
各濃度のCDを4つのウェルで測定した（n=4）。
化学発光強度は実験間で変動したため，最終的なデータは正規化した。
（すなわち，0 µg/mlのCDを100%とした）
結果と考察 図1に示すように、ヒトACE2タンパク質とスパイクタンパク質RBDとの結合強度は、CDの濃度が高くなるにつれて低下した。
50％の結合阻害を与えるのに必要なCD水溶液の濃度（IC50）は、イギリス変異体で7.6μmol/L、南アフリカ変異体で5.8μmol/Lであった（表1）。
また，CDスプレーを用いた場合にも，CDの阻害効果が認められた（図2）。
具体的には，ACE2とスパイクタンパク質RBDとの結合のIC50は，
イギリスと南アフリカのバリアントでそれぞれ15.3µmol/Lと4.7µmol/Lであった（表1）。
さらに，Wuhan株のスパイクタンパク質RBDとACE2の結合もCD水溶液で阻害され，IC50は6.5µmol/Lであった（Ogata N, unpublished data）。
これらの実験では，CD水溶液とCDスプレー液の間で阻害効果にわずかな違いが見られた。
このような違いが見られたのは，製品の保存期間を延ばすために添加されている，スプレー液に含まれる他の成分の影響によるものと考えられる。
これらの結果は，いずれのCD溶液も，SARS-CoV-2ウイルスとヒト細胞受容体ACE2との結合を不活性化する効果があることを示唆している。
そのため、CDはウイルスの感染を抑制する作用があると考えられる。
SARS-CoV-2ウイルスのスパイクタンパク質のRBDは、S1
図1：in vitro実験におけるSARSCoV-2ウイルスのスパイクタンパク質の変異体の受容体結合ドメイン（RBD）とヒトのアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合に対する二酸化塩（CD）水溶液の影響を示したもの。
イギリスの変異体（塗りつぶした円）と南アフリカの変異体（開いた円）のスパイクタンパク質のACE2への結合を示す。
各点は、4回の実験（n=4）の平均±標準偏差を表す。
図2：in vitro実験におけるSARSCoV-2ウイルスのスパイクタンパク質の変異体の受容体結合ドメイン（RBD）とヒトアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）との結合に対する二酸化塩素（CD）スプレー液の影響。
イギリスの変異体（塗りつぶした円）と南アフリカの変異体（開いた円）のスパイクタンパク質のACE2への結合を示す。
各点は、4回の実験（n=4）の平均±標準偏差を表す。
IC50 (μmol/L)
CD水溶液：British variant 7.6 South African variant 5.8
CDスプレー液：British variant 15.3 South African variant 4.7
表1：変異型SARS-CoV-2スパイクタンパク質（Sタンパク質）の受容体結合ドメインとヒト受容体タンパク質ACE2との結合を50％阻害するのに必要な二酸化塩素（CD）水溶液の濃度（IC50）を示す。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）のバリアントを、二酸化塩素（CD）水溶液またはCDスプレー液で様々な濃度で処理した後、受容体タンパク質ACE2との結合能をアッセイした
Norio Ogata, et al.、Annals of Pharmacology and Pharmaceutics Remedy Publications LLC. 3 2021｜第6巻｜第1号｜第1199条
スパイクタンパク質のサブユニットで、RBDのACE2と相互作用する領域は、25アミノ酸残基の小さなパッチからなる[18]。
両方のウイルス亜種でチロシンに変異しているアスパラギン501（N501）残基は、スパイクタンパク質のRBDパッチ領域の一部を形成しています[5]。
N501Yの変異は、ヒトのACE2との結合親和性を高めることで、ウイルスの伝達性を高める結果になると考えられています[18]。
さらに、この変異により、ウイルスに対する多くの抗体からウイルスが逃れることができるため[18]、これらの変異株のSARS-CoV-2ウイルスに対するワクチンの効果が低いことが示唆されていることも注目に値する。
我々は以前，武漢株のスパイクタンパク質RBDとヒトACE2との結合がCD水溶液によって阻害されることを示した[19]。
これらの知見から、CDはウイルスに対する殺菌剤として有用であることが示唆された。
この阻害のメカニズムは解明されていないが，我々は，ACE2と水素結合を形成しているスパイクタンパク質のRBDのチロシン453残基の酸化が関与しているのではないかと推測した[19]。
実際、CDはタンパク質のチロシン残基を酸化することが知られている[16]。
変異株では、アスパラギン501がチロシン（Y）に変異しているので、CDでウイルスを処理すると、501Yも酸化される可能性があります。
変異株に対するワクチンの効果が薄れてきていることを考えると、CDを用いた消毒システムは非常に有効であると考えられます。
また、CDは室温では気体であり、この状態で空気中の微生物を人体に安全な濃度で不活性化することができることも重要である[17]。
そのため，気体のCDは，混雑した部屋の空気中に浮遊するSARS-CoV-2ウイルスの不活性化に使用できる。
結論
CDを水に溶かしたものでも，水に溶かしてスプレーしたものでも，スパイクタンパク質RBDとヒト受容体タンパク質ACE2との結合を，濃度依存的に強力に阻害することがわかった。
これらの結果は，CDがSARS-CoV-2ウイルスのヒトへの感染を抑制する上で非常に有効であることを示唆している。
謝辞
著者らは大幸薬品株式会社の社員である。
本研究は、同社の支援を受けて実施した。
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