舞台は1936年プリンストン大学で教鞭を執る高名な考古学者インディアナ・ジョーンズ教授(インディ)には、愛用のハットと鞭を手にして秘境や遺跡を探検する冒険家であり、世界中の宝物を探して発見するという凄腕のトレジャーハンターとしての顔があった。

南アメリカの森からホビット族の追跡を感じながらチャチャポヤンの遺跡へ向かうところから始まる。トラップは、ほぼ知っている様で無事にゴールデンアイドルが手に入るが遺跡を出るとルネ・ベロックからゴールデンアイドルを奪われ更にホビット族からの追跡が続く所がOPとなっている。

ある日、陸軍諜報部よりインディの下にナチス・ドイツタニスの遺跡を発見して聖櫃(アーク)の発掘に着手したという情報が舞い込む。また情報部が傍受したドイツ軍の電報によれば、聖櫃の在り処を示す重大な手がかりラーの杖飾りはインディの恩師であるアブナー・レイヴンウッド教授の手にあるという。何としてでもナチスより先に聖櫃を手に入れろとの依頼を受け、インディは聖櫃の争奪戦に臨む。その頃、インディのライバルでもあるフランス人考古学者ルネ・ベロックは、ドイツ国防軍聖櫃発掘部隊の指揮官であるヘルマン・ディートリッヒ大佐と共に、エジプトカイロ近郊のタニス発掘現場へと送り込まれていた。

インディはアブナーの日記を手がかりに、一路ネパールヒマラヤ山脈奥地の寒村へと向かう。アブナーの娘であり、かつてインディの恋人でもあったマリオン・レイヴンウッドが営む酒場を訪れるが、既にアブナーは死亡していた。マリオンも今やインディに協力的ではなく、また明日来るようにと言ってインディを追い返すが、直後にインディを尾行していたゲシュタポのエージェントアーノルド・エルンスト・トートらが酒場に現れ、マリオンに杖飾りを渡すように強要する。トートはマリオンの目を火かき棒で焼き潰そうとするも、間一髪でインディが現れてこれを阻止。炎に包まれた酒場での銃撃戦の中、トートは炎に炙られていた杖飾りを見つけて拾い上げるものの、手のひらに火傷を負い、あまりの苦痛に杖飾りを手放して店を飛び出してしまう。結局、店は焼け落ちて、杖飾りを取り戻したマリオンはインディと共にエジプトへと向かうのであった。

カイロに到着したインディは、友人の発掘王サラーを頼りにタニス発掘の情報を集める。しかし、ディートリッヒの部下に襲撃を受け、マリオンがトラックの爆発に巻き込まれてしまう。その上、既にドイツ軍が杖飾りを入手していることを知る。実はディートリッヒらに合流したトートの火傷痕から複製されたのだが、杖飾りは両面そろって初めて正しい発掘場所を示す為、片面しか得ていないドイツ軍は未だに聖櫃が隠された「魂の井戸」の特定には至っていない。

次の日、インディとサラーはエジプト人採掘者に紛れてタニス遺跡の発掘現場へと潜入し、本物の杖飾りを用いて「魂の井戸」の場所を突き止め、さらに生きたまま捕えられているマリオンを発見する。そして密かに発掘を行い、ついに「魂の井戸」と聖櫃を発見するも、明け方になってベロックらに現場を見つかってしまう。インディは聖櫃を奪われた上、マリオンと共に「魂の井戸」に閉じ込められてしまう。

「魂の井戸」からインディとマリオンは脱出して、脱出した先の飛行場で聖櫃をタニスからベルリンへ空輸される準備に取り掛かっているところを目撃し、輸送機に紛れ込もうとするが、整備士に見つかり乱闘になる。マリオンはパイロットを気絶させるが、輸送機に閉じ込められてしまい、さらに輸送機が動き出し、回り始めてしまう。インディが屈強な兵士と争ってる所にドイツ軍の援軍がやって来て、マリオンが輸送機の機銃で応戦するが、その際燃料の保管場所にも命中して爆発、さらに輸送機の翼に当たって給油車から漏れたガソリンに引火してしまう。激闘の末、インディと格闘した兵士は輸送機のプロペラに引き裂かれ、インディは輸送機の扉を銃撃してマリオンを救出し輸送機が爆発する前に脱出、タニスから聖櫃の空輸を阻止することに成功する。

ベロックらは計画を変更し、カイロで聖櫃を空輸することに変更し、テントに隠れていたインディとマリオンを発見したサラーはそれをインディに伝える。ベロックらは聖櫃を積んだトラックと共にカイロへと向かうが、馬で追跡してきたインディはトラックごと奪い、カイロでサラーの用意したガレージに身を隠す。インディとマリオンは聖櫃と共にイギリス行き貨物船バンツー・ウィンド号に乗り込みエジプトを脱出した。しかし翌朝にはUボートが現れ、ディートリッヒ率いるドイツ兵の臨検を受けて再び聖櫃は奪還され、マリオンも捕えられてしまう。一方のインディは、船長が「海に始末した」と偽ってドイツ兵の目を欺いてくれた隙に、Uボートの外側にしがみ付いていた。

聖櫃を積んだUボートはギリシャクレタ島の秘密基地に到着し、陸に上がったインディは警備兵の制服を奪う。ベロックが儀式の再現を提案すると、当初ディートリッヒはユダヤの儀式だとして反対したものの、空の箱を総統に届ける訳にはいかないと説得され、渋々ながらこれを認める。儀式を行うべく聖櫃を運搬している最中、再びインディの襲撃を受ける。ロケットランチャーを手にしたインディはマリオンを返さなければ聖櫃を破壊すると脅迫するものの、考古学を愛するインディが聖櫃を攻撃できるはずがないと踏んだベロックは交渉を拒否。捕えられたインディはマリオンと共に柱に縛り付けられ、彼らの目前でついに儀式が開始された。

ところがベロックが聖櫃のフタを開くと砂が入っているばかりである。ディートリッヒは激怒し、トートは嘲笑したが、直後に精霊が飛び出してドイツ兵たちの間を飛び回る。すぐさまインディはマリオンに目を閉じるように言って自らも目を閉じる。直後に精霊は豹変し、聖櫃から飛び出した雷撃がドイツ兵を皆殺しにした。そして、ベロックはディートリッヒやトート共々生きたまま溶解され、殺されたのである。インディとマリオンがようやく目を開けると、もはや人の気配はなく、聖櫃だけが残されていた。

その後、インディはワシントンにて陸軍諜報部への報告を終え、マリオンと共に街へと向かう。そして聖櫃が納められた木箱は「安全な場所」、すなわち無数の木箱が並ぶ政府機関の地下倉庫(エリア51)に隠されたのであった。