私たち一般人は、残念ながら、実験の細かい手技を知ることができません。
しかし、”だいたいこんなもの”という感触はつかむことができます。
やっぱりさんのご教授により、メチル化実験の情報サイトをさがせました。この方法では全ゲノムを調べられるので、大腸菌は使わないのでは?

やっぱりさんからご教授いただいた大腸菌を使うメチル化実験の方法は、以前の検査法だったのでしょうか?
そうなら、学とみ子は間違えていました。すみません。

学とみ子が大腸菌のお話を聞いた当初は、メチル化実験って、ずいぶんと不安定な検査法だなあと思ったものです。
オホホポエムでも、大腸菌を使用して、遺伝子を入れ込む方法論がでてきましたよね。
まあ、そのうち、この検査法がわかるかもしれませんので、それまで待ちましょう。
とにかく、今のメチル化実験は、バイサルファイト処理法なのですね。
そして、受託業者もいますね。
以下は、そのうちの一社でしょう。

今回、紹介するのは(青字) ばらつきはなさそうですね。

全ゲノムバイサルファイトシーケンス(WGBS)

WGBSでは次世代シーケンサーを用いて全ゲノム上の網羅的なメチル化状態を検出することが可能です。
ライブラリーの調製中にバイサルファイト処理を行い、シーケンスデータ中のチミンとしてメチル化を検出します。また、NGSで出力されたリード数を比較することによってメチル化レベルを測定できます。
WGBSは探索を目的とした網羅的なアプローチに向いた実験手法です。
しかし、サンプル当たりのシーケンスデータ量が膨大となり、シーケンスワークフローも煩雑になるという欠点も有しています。
これを解決するために特異的な認識部位を濃縮するなど一部にターゲティングしてバイサルファイト処理を行う手法が選択肢として挙げられます。
Premium WGBS kit (全ゲノムバイサルファイトシーケンシング)(グローバルサイトにリンクします)



さて、ついでだから、今回、メチル化実験の論文を紹介しましょう。


化学物質誘導のiPS細胞(C-iPSC)と、山中因子挿入によるOSKM-iPS細胞(4F-iPSC)、(いわゆる一般的iPS細胞)のメチル化状態を、それぞれ、ES細胞と比較した2018年のPingらの論文です。

Cell Death Dis. 2018 Feb; 9(2): 187.
Published online 2018 Feb 7. PMCID: PMC5833453 PMID: 29416007

Genome-wide DNA methylation analysis reveals that mouse chemical iPSCs have closer epigenetic features to mESCs than OSKM-integrated iPSCs

この論文出だしのイントロダクションで、いわゆる一般的iPS細胞(4F-iPSC)の問題点に触れています。
4F-iPSCでは、マイクロRNA、long non-coding RNA、コピー数など、遺伝子様式の変化が起きていることや、キメラマウスの腫瘍形成(C-Myc)が指摘されています。

さらに、4F-iPSCは、遺伝子の安定性、X染色体の不活化(女性は一方のX染色体が不活化)で問題があり、4F-iPSCのハイパーメチル化状態残存が、結局、多能化細胞としてのリプログラミング効率を低下させ、特に血液細胞への誘導を低下させるようです。

Ping らの論文は、一般的遺伝子挿入のiPS細胞(4F-iPSC)と比較して、化学物質で誘導した iPS細胞の利点を主張した内容です。時間をかけて、細胞を改変し、選択を繰り返す人工的作業により、分化細胞が初期化します。


人工的多能性細胞である両者において、エピジェネティックな同等性について、どちらが有利か?を比較しています。

重亜硫酸塩の配列決定方法を用いて、 3種のマウス多能性幹細胞において、共通的に脱メチル化が確認されました。
しかし、メチル化状態には違いがありました。
C-iPSは、4F-iPSCよりも脱メチル化されています。
すなわち、C-iPSCは4F-iPSCよりもメチル化がはずれ、よりES細胞に近い状態でした。
遺伝子全体で、C-iPSCは、4F-iPSCよりも脱メチル化されていました。

さらに、一部の特定の領域(レトロトランスポゾンなど)のDNAメチル化にも違いがあります。
遺伝子のインプリント部位においても、違いがありました。
Dlk1-Dio3およびPeg12-Ube3aなどのインプリント領域(既知の刷り込みクラスター)において、DNAメチル化状態は、4F-iPSCよりもC-iPSCは、ESCに近い状態でした。


plus99% さん、なにやら、つぶやいてますね。

2020年1月23日 7:45 PM
>ボスの言うのは実験を考え直せという意味なんですな。

普通は、ボスが部下を叱咤激励する時には、「もっと実験を工夫して、正確な結果を出せ!」でしょう。
そもそも、若山氏がこの場面でどんな発言したかは不明です。
桂報告書にはこうあります。
>少なくとも若 山氏は、小保方氏の指導監督を怠り、・・・
これも違いますね。

小保方氏は、分化細胞よりメチル化がはずれていれば十分だったのではないですか?
むしろ、正確さを求めれば、ES細胞よりSTAP細胞はメチル化している必要があったのですよ。
こちらが、STAP細胞の実力を表し、より正確ということです。

しかし、ボスは、もっとES並みにメチル化がはずれていると誤解したのかも?・・・
つまり、ボスは、小保方氏と違って、STAP細胞のES並みの多能性を信じていたということです。
これって、”小保方氏の指導監督”とは違いますよね。

又、STAP細胞は、独自の状態の脱メチル化が進行していることも、しっかり確認できました。


追記

味噌マニアさんのコメントです。
2020年1月24日 7:09 AM
>鉄面皮。わかんなくて拝んで教えてもらって、

メチル化と大腸菌の話は、やっぱりさんを拝んで教えてもらったわけでない。セイヤさんのいう通り、やっぱりさんは、学とみ子けなしついでだったと思う。それが間違っていた?それとも、その後に方法論が変わった?

いづれにしろ、知識の無い部分は、教えてもらうことが多いが、その責任は、教えてもらった方にありでしょうね。情報の選択能は、本人にあります。人は、細胞でできてるから、細胞に選択能力があります。

一生、学びだあーーー。



さっそく、やっぱりさんから、更なるご教授ありました。今回は、バッチリ更なる説明でした。ありがとうございます。以下の最後の揚げ足取りコメントなければ、もっと良いですが。

>STAPの議論をしているつもりなんですかねえ。

やっぱりさんの説明ですが、大腸菌を使うと、個々の大腸菌クローン増殖にばらつきありますよね。
結果、判定基準もばらつきますよね。
こういうタイプの実験は、実験指導者が決めたら、部下は従いますよね。


>目的遺伝子PCR増幅
  ↓
産物をプラスミドと連結、大腸菌へ導入
  ↓
大腸菌クローンよりプラスミド抽出

やっぱりさんの説明です。
>理研が公開している報告書関連資料すら知らずに(読めずに?)STAPの議論をしているつもりなんですかねえ。

日本人なら誰でも、視力がある限り、誰でも見ます、見れますね。
学とみ子は、上記資料を見つけてなかったし、メチル化実験の詳細を知りたいとも思わなかったです。
学とみ子が、見つけていなかった事がミスだと吹聴するんですね。

けなせるものは何でもとりあげてけなすんですね。
では、学とみ子もお返しを。
TCR遺伝子の長さは、数百bpなんですよね。やっぱりさん。
やっぱりさんは、手を動かす細かい実験をこなしてきた方ではありませんか?
ですから、大局的生物学理論には弱いのでしょう?

こうした他人の揚げ足とりは、学とみ子自身で、情けない!と思います。
しかし、あちらのES派の人たちは、共通して揚げ足取りがお好きです。
ご自身を情けない!とは思わない性癖の人たちのようです。

ため息グループの人って、他人をバカにできる材料を見つけては、そこを拡大させて、集団いじめに精を出し、喜ぶ人たちです。
ホントに、皆、そこが共通です。

小保方ES捏造のままで世の中がやり過ごしてほしいとの目的のあるため息グループ活動ですが、今は、あちらは集団いじめの楽しさのようです。まあ、臭いものさがしの旅のお楽しみも良いでしょう。


それより、メチル化実験は、不安定な検査だろうから、こんな実験で、小保方氏は捏造のレッテルを貼られてしまったのか?との、学とみ子の思いです。

今回、さらに、学とみ子は、メチル化実験の新たな”からくり”を知りました。
小保方氏は、当時、実験室の周りにうごめく画策学者の罠にかかっていたようです。
キメラTCRの図だって、おかしな図ですもの。
若山研究室はもちろん、理研のだれも、説明しようとしません。
今の小保方氏は、こうした悪質きりない画策学者との戦いをきっぱり捨てたのかもしれません。

ため息さんや、やっぱりさんとのやり取りはきりないですね。
彼らの仕掛ける侮辱と罵倒は、学とみ子は取り合わないつもりでしたが、今回のやっぱりさんの貴重情報で、学とみ子は考え直しました。
やっぱりさん、やっぱり、学とみ子は、もっと知りたいです。

彼らの問題点は、自分自身が見えない点で、そこがSTAP派の人たちとの大きな違いだと思いますね。

追記
ため息さんのコメント、2020年1月24日 5:46 PMで、ため息さんの知ったかぶりです。

ため息さん、メチル化実験には詳しく無いと思いますが、やっぱりさんの受け売りそのままです。一般人の手法並みに、最初から知ってる人を装っています。ため息さんは、メチル化実験関連の論文は読んでないのにね。

大腸菌に入れ込む方法は、その菌の増殖程度に依存するでしょうから、増殖程度をどう評価するかで、判定結果がばらつくと思います。小保方氏が、黒と白を塗り変えたと、素人が思う内容では無いと、学とみ子は言おうとしてます。小保方氏は、捏造者として、ここでも強く印象操作されてしまいました。

学とみ子はそうした疑問を書いているのに、ため息さんはメチル化実験を知ったかぶりをします。
いつもの悪い癖です。

ため息さんのコメントって、又か!とやり過ごした後で、たまたま見ると、バカなこと言ってるんですよ。
知ったかぶりがバレるのです。
例えば、以下の文章です。

>6年前はどうだったか知りませんが、メチル化の測定方法自体は研究対象ではなくルーチンの仕事になっているのがわかるわけで、無能なのはどちらなのかすぐわかりますな。

6年前と、今の状況の両方の状況比較が必要です。6年前にどうだったか?に触れず、ため息さんは、何を語りたいの?大事な事は何にも語れないため息さんの現状を示してます。


>6年前はどうだったか知りませんが、メチル化の測定方法自体は研究対象ではなくルーチンの仕事になっているのがわかるわけで、無能なのはどちらなのかすぐわかりますな。

この答えは、ため息さん。



さて、現状のメチル化実験について、
STAP実験で使われた方法から改良されて、今は大腸菌を使わない方法があると思うのですが、どなたか、詳しい方いますか?

大腸菌の増殖は誰がやったのでしょう。GRASではないですね。


あくまでも、学とみ子に噛みつきたいため息さんです。
>学とみ子は何も知らないのに、「判定結果がばらつく」などとでたらめな評価を行い、妄想に由来する不正行為の程度を低く見るような態度を批判しているのですよ。わからないの?無能だから無理か。

いくら、若山研究室がメチル化実験に熟達していても、生物の培養はコントロールが難しいです。現実に、調査委員会から、クローンの質が悪いと言われてますね。判定がばらつくという意味かな?そういう実験なんでしょう?。STAP細胞という特殊な細胞を取り扱った結果、判定が難しくなったんではないですか?ベテランの若山研究室員が関わった部分が大きいと思いますよ。 やっぱりさんは、GRASの役割が大きいと言いましたが、実験の詳細は明らかではありません。誰が何を言ったか?わかりませんが、若山氏がトンデモ発言をしたとは思いません。

むしろ、若山氏を守ろうとする力やら、又、国の直轄の理研上層部事務方の意向の前に、若山氏は発言の機会を逸したと思います。

今も熱心な若山擁護派の活動は、若山氏の真実吐露決断の妨げでしょう。小保方氏に全てを押し付けたメチル化実験指導者の名前は出てきません。小保方氏を含め皆黙っています。周りの実験仲間の人たちに配慮したら、お互いに黙っているしかないのでは?

STAP擁護派は、第三者ですが、若山擁護派は、そうでは無い事件関係者ですから、STAP派にたいする攻撃は強く、長く、執拗に侮辱、否定活動を続けると思います。

STAP擁護派は、無料媒体を使って、人々に科学を考える機会を提供していけば、科学世界を支える一般力になるでしょう。

元、科学界にいた人が、古い的外れの理論を振り回しても、もはや、通用しない一般人の科学力が、既に出来上がっていると思います。

画策学者たちは、科学の理解が不十分で自身のレベルがわからない一般人を、その気にさせます。人は、わからないことに気付けません。間違っていても正しいよ!といわれてしまうと、それ以上を追及する能力がありません。

ES捏造論者は、ちぐはぐ主張を繰り返し、一般人の科学心を刺激します。

過去に、不十分な知識のままでも通用してきた人生経験の方々は、こうした画策学者から、自己満足を与えてもらえます、画策学者の偏向に影響されやすいでしょう。自身の科学力や批判力の欠如です。

それでも、不十分知識の繰り返しと、議論相手への悪口が通じる平和な日本です。

信じこんだES捏造論を正しいと、自らの信念で満足してしまう科学音痴の人たちは、そこに居続けるでしょう。

人は誰でも、自己主張のできる世界から離れることができません