5年たっても、専門家層からの有用な解説がでてこないSTAP細胞です。
素人にできることは、再度、原点にもどり、残された数少ない資料を読んで、又、新たな探索の道を歩むしかありません。
上記は以前に紹介した丹羽論文ですが、この論文の一番大事な部分を書き出してみました。
ハーバードの再現実験では、Oct遺伝子の質がSTAP細胞とは違っていました。こうした細かい違いを一般人がフォロウするのは難しいです。一方、丹羽論文では、そこが分けて論じられています。
この論文で大事なのは、
Oct遺伝子において、もともとマウスが持っている遺伝子と、人工的に挿入された人工Oct遺伝子とを、分けて論じていることです。
研究者レベルの読者であれば、当然、本来の真正遺伝子か、挿入遺伝子かを説明文脈から理解できるのでしょうが、一般人は論文を読むのが精いっぱいです。
この違いを理解できるようにと、丹羽氏は配慮し、STAP論文で用いらたGOFマウスの問題点を教えてくれています。
丹羽氏の教えは、赤、緑フィルターだけではわからないという事実のようです。
さて、このSTAP実験では、自家発光か？そうでないか？がずいぶんと議論されましたが、丹羽論文ではGOFマウスは、自家発光しやすい欠点があると書いています。
しかし、実際にはフィルターでは検出できないが、OctはｍRNAや蛋白レベルで発現しているのでは？とも書いています。
こうしたことを書くと、又、大変な攻撃が来るかと思いますので、その前に断ります。
グーグル翻訳を参考にしましたが、日本語部分は訳ではありません。
訳というより、丹羽論文を読んで、こうした事が書かれているとの学とみ子の感想となります。
オリジナル英文を載せましたので、優先に読んでください。
どう読むか？は、読み手の自由ですし、学とみ子の妄想とお呼びいただいてもかまいません。
科学的に学とみ子の間違いがあれば、どうぞご指摘ください。
妄想とされる方は、その妄想とやらの根拠を教えてくれればありがたく拝聴します。
STAP論文は否定された論文だから、何を言おうと無駄だとか、いまさら、つまらないコメントは、ご遠慮ください。
この論文の結論ですが、STAPオリジナル論文で報告したレベルの多能性は証明できないとなっています。
しかし、丹羽論文は、あくまでキメラ形成能を含めての多能性達成を目指しています。
キメラは若山氏の作製なのですから、理研の行った再現実験は、小保方氏、若山氏参加でやるべき質のものであったのに、実際にはそのような方向で実験計画を作れなかったわけです。
STAP研究にかかわった研究者たちの思惑の違いが、再現実験失敗の悲劇を生んだのですが、この時、解決に焦っていた理研は、どのような立場の研究者と言えど、
「STAP細胞は再現できない！」
としてくれたらありがたいと思ったのではないでしょうか？
理研の頭脳を集めて、STAPは無い！と。
理研は、ここを高らかに宣言してしまったばっかりに、日本中の科学者層がそれに賛同することが（暗黙に）求められたのではないか？と思います。
STAP細胞が無いというのは仕方ない部分がありますが、それがES細胞だっというのははなはだ無理な話です。
しかし、それが、当時の理研と研究者の価値観だったのではないでしょうか？
そうした雰囲気の中で、丹羽論文は書かれました。
論文の主要な部分は、STAP細胞の多能性は無い！でした。
しかし、酸浴により細胞は凝集しOct遺伝子が発現するとしたこの論文の意味は大きいものです。
酸浴させると、その後、生き残った細胞が凝集し、Oct遺伝子発現、Oct蛋白合成を証明できた事実を、論文から読み取ってください。
全論文のうち、以下の部分が一番大事な部分ですが、論文ではここが一番大事であることがわかりにくくなっています。
しかし、反ES論を進める者にとっては、とても大事な部分で、特許申請もここを論拠として、現在も作業が続けられています。
We next performed qPCR on individual cell aggregates isolated from culture. Aggregates were selected and RNA samples were prepared separately. These RNAs were reverse-transcribed and qPCR was performed. We found that some aggregates expressed a comparable amount—more than 10% of the expression level in ES cells—of pluripotency-associated genes, including Oct3/4 (Fig. 3b). Since the cell aggregates consist of ~10 cells, such expression level indicated possible existence of the cell(s) expressing pluripotency-associated genes at the equivalent level to that in ES cells. Klf4 expression was detected in all samples, which may reflect its expression in liver cells, and thus serves as a positive control in this assay. Of cell aggregates derived from liver cells treated with ATP, 19% expressed the amount of Oct3/4 comparable to ES cells (Fig. 3c). These data suggest that some proportion of cells in the aggregates express pluripotency-associated genes at comparable levels to those of ES cells.
To examine the proportion of the cells expressing Oct3/4 in the aggregates, we next applied immuno-staining using a specific antibody against Oct3/4 we raised and assessed previously15. Cell aggregates derived from low-PH treated liver cells were fixed, stained by anti-Oct3/4 antibody, and observed using confocal microscopy. We stained morula-stage mouse embryos as positive controls. By comparison with these positive controls, we found that some of the cell aggregates contained cells expressing Oct3/4 at comparable levels (Fig. 4a). In the case of cell aggregates derived from liver cells treated by ATP, 20% of cell aggregates contained Oct3/4-positive cells (Fig. 4b), which is consistent to the proportion of cell aggregates expressing the amounts of Oct3/4 comparable to ES cells detected by QPCR (Fig. 3c).
In contrast, cell aggregates derived from liver cells treated by HCl included Oct3/4-positive cells at a frequency comparable to that of non-treated cells.
The presence of Oct3/4-positive cells in the cell aggregates found only 1 in 14 cases in cultures of non-treated liver cells suggests that such cells are derived from Oct3/4-positive cells present in the liver cell population, that in vitro culture may itself be a source of the stress to the cells, or that the immuno-staining technique may produce some non-specific signal. In cell aggregates derived from ATP-treated liver cells, the Oct3/4-positive
In the original report, the authors used transgenic reporter gene expression as a marker of pluripotency1. This reporter consisted of the transcriptional regulatory element of Oct3/4 and the fluorescent marker GFP, designated GOF, which is silent in somatic cells and activated in pluripotent cells14. When we used the same transgenic mouse line as a source of dissociated cells, we found that they began to acquire strong auto-fluorescence in culture after ATP treatment. On observation with fluorescent microscopy, most aggregates showed both green and red fluorescence, a sign of auto-fluorescence (Fig. 5a) although this may also include the fluorescent signal from the GOF transgene, since we detected Gfp mRNA by qPCR in these cells after culture in vitro for seven days (Fig. 3a).
In cell aggregates derived from ATP-treated liver cells, the Oct3/4-positive cells were typically positioned in the center of the cell aggregates and exhibit large nuclei, and were surrounded by Oct3/4-negative cells with small nuclei at the peripheries of the cell aggregates (Fig. 4c).
Specific detection of GFP fluorescence by fluorescence-activated cell sorting (FACS) was also performed. In spleen cells collected using Lympholyte, CD45-positive/E-cadherin-negative blood cells were enriched. The reprogramming of such cells to a state of pluripotency can be monitored by their conversion to CD45-negative/E-cadherin-positive cells and acquisition of GFP expression from the GOF transgene. However, although we again observed increased auto-fluorescence and some reduction of CD45 expression, neither a specific signal of GFP fluorescence nor an increase of E-cadherin expression was observed in the low-pH treated cells (Fig. 5b). Given these findings, we suggest that that there was no evident sign of reprogramming in low-pH treated spleen cells based on the expression of the GOF transgene.
次に、個々の細胞凝集塊に対してqPCRを行った。いくつかの凝集壊が、Oct3 / 4 を含む多能性関連遺伝子を、ES細胞と匹敵する量（ES細胞における発現レベルの10％以上）で発現することを見出した（図3b）。細胞凝集塊は約10個の細胞からなるので、この発現レベルは、多能性関連遺伝子を発現している細胞が、ES細胞と同等のレベルで存在する可能性を示唆していた。 Ｋｌｆ４発現は全てのサンプルで検出されたのは肝細胞である事を反映している可能性があり、陽性対照とした。 ＡＴＰで処理した肝細胞由来の細胞凝集塊のうち、１９％がＥＳ細胞に匹敵する量のＯｃｔ３ ／ ４量だった（図３ｃ）。これらのデータは、凝集細胞は、多能性関連遺伝子をES細胞に匹敵する量で発現することを示唆している。
Oct3 / 4を発現する細胞塊の割合を調べるために、Oct3 / 4に対する特異的抗体を用いて免疫染色した。低PH処理肝細胞由来の細胞凝集塊を固定し、抗Oct3 / 4抗体で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。陽性対照として桑実胚期マウス胚を染色した。これらの陽性対照と比較して、細胞凝集塊のいくつかがOct3 / 4が陽性だった（図4a）。 ATPで処理した肝細胞由来の細胞凝集塊の20％がOct3 / 4陽性細胞を含んでいた（図4b）。
対照的に、ＨＣｌで処理した肝細胞由来の細胞凝集塊においては、Ｏｃｔ３ ／ ４陽性細胞は、未処理細胞と同程度であった。酸浴のない肝細胞でも14凝集塊の１つにOct3/4陽性細胞があり、肝細胞でOct3/4陽性となった理由は、培養自体が細胞へのストレスになっていたか、免疫染色技術上での非特異的なシグナルかもしれない。
元の報告では、著者らは多能性のマーカーとしてトランスジェニックレポーター遺伝子発現を使用した。 このGOFと呼ばれるレポーターは、Oct3 / 4の転写調節エレメントと、蛍光マーカーGFPから構成される。体細胞では、本来、Oct3 / 4の転写はなく、多能性細胞では活性化される。 同じトランスジェニックマウス系統を実験に使用すると、ＡＴＰ処理後、強い自己蛍光した。 蛍光顕微鏡では、ほとんどの凝集塊で、緑色と赤色の両方の蛍光、つまり、自己蛍光の徴候を示した（図5a）。しかし、７日間培養細胞において、GOF 導入遺伝子のGfp mRNAをqPCRでは検出できることから想像すると （英文ではmay）、GOF導入遺伝子からの 蛍光シグナルが含まるだろう。（図３ａ）。
ATP 処理肝細胞由来凝集塊において、典型的Ｏｃｔ３ ／ ４陽性細胞は、細胞凝集塊の中心に位置し、大きな核を示し、その周囲に小さな核のＯｃｔ３ ／ ４陰性細胞に囲まれていた（図４ｃ）。
ＦＡＣＳにより、GOFマウス脾臓細胞において、ＧＦＰ蛍光の特異的検出をした。
まず、脾臓細胞から、CD45陽性/ E-カドヘリン陰性のリンパ球を集めた。 多能性状態への再プログラミングは、CD45陰性/ E-カドヘリン陽性細胞への移行と、GOF導入遺伝子からのGFP（緑色）によりモニターすることができる。 低ｐＨ処理すると、ＣＤ４５発現がいくらかの減少するのを観察できるが、Ｅ−カドヘリンの増加はなく、ＧＦＰ蛍光の特異的シグナルもなかった（図５ｂ）。 GOF導入遺伝子を用いた実験においては、低pH処理脾臓細胞で初期化現象が起きるとの明白な徴候が得られなかった。
>> 学さん
アルイミオウジ氏も気づかれていなかったですが、～10は肩の小さい3が脱落しているんです。10の三乗です。つまり～1000で、スフィア塊は最大1000個程度の細胞で構成されているという意味です。このことはスフィア塊の写真を見ればわかる通りで10個以下なんてことはあり得ませんし、球を想定して計算しても1000個程度とわかりますし、ティシュー論文以来細胞塊は約1000個の細胞でできていると書き継がれていることでもあります。誤植の類なんですけど、あの分析に丹羽さんが10個のESを基準にしていることでなんとなく曖昧に気づかずに読み過ごされていることが多いようです。
（図3b）は約1000個の細胞で構成されているスフィア塊を10個のES細胞のマーカー遺伝子発現量と比較したものが19例並べてあるグラフです。メモリは対数表示で、Oct4に関して言えば0.1のライン以上が4例あるということです。10個のESの発現量との比較ですから、0.1の近辺では1個分が発現しているということです。1000個の中の1個です。しかも比較的発現のある19例を並べてあるんですから、何もない事例もあるということです。1000個の19例だと19000ですが、スフィア塊は20から30個程度形成されたと書かれています。で、結果的に最大30スフィアの20%つまり最大6個のスフィアのそれぞれに1個か2個の内在性Oct4遺伝子発現があった。つまり最大12個あったという結論なんです。それは最初の50万個の細胞に対しては0.0012–0.0024%であるということですね。
これでもティシュー論文では試験管内三胚葉分化も足場付きテラトーマならできているわけです。それは大量に入れた細胞の中の一個でも多能性細胞であれば分化するからですね。これが今でもヴァカンティが特許申請継続している理由です。でも、相沢さんと丹羽さんの検証目的は理研の名前で出しているネイチャー論文の骨子通りに特許も申請していますから、キメラが再現できるか否かだけが検証の目的で、理研の予算を使って行っているのですから、ティシュー時の細胞が何であったかなどという検証はやれません。目的が違うということです。結果は、再現できないから特許申請は取り下げるというものです。
そこの理解に関して一致できれば、今度は丹羽論文の曖昧さに関しても指摘できることになると思います。ES10個分の発現量と比較して0.1は確かに1個分ですけど、これは必ずしも一個だとは言えませんよね。1/100が10個集まったら1/10です。1/1000が100個集まっても1/10です。とても微量な発現がたくさんあるという可能性を否定できていませんね。
（図4a）に2個のスフィア塊の中で11個のOct4発現個別細胞が免染で黄色く着色されているのが見えます。結論には6個のスフィア塊の中に1から2個だったはずですね。これは1から2個分の発現量と読み替えないといけないんでしょうね。
>>However, the frequency was very low; 5 × 10^5 liver cells yielded only ~30 cell aggregates, in which about 20% of the cell aggregates contained 1–2 Oct3/4 positive cells, indicating a frequency per seeded liver cell of 0.0012–0.0024%.
このことはGFPの蛍光に関しても言えるかもしれません。Ooboeさんのパートナー氏は予備的再現実験時の小保方さんの作った自家蛍光ではない沢山の蛍光細胞の出現写真をガンバレブログにアップされています。亜致死酸浴下条件でOct4-GFPが内在性Oct4遺伝子発現に正確に比例して発現するのか否かはわかっていません。こんな実験をしたのは小保方さんが初めてだからです。丹羽さんも1割程度の漏れ出しという現象を発見しています。分かってないことが多いですけど、前述した通り理研の検証実験は特許申請維持の可否検証が目的ですので多くを要求することはできませんね。事件は複雑なので、多面的に検討していくしかないと思っています。以上です。
ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。
ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。
つまり、ＡＴＰ酸浴後幹細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。
ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。
すなわち、ＳＴＡＰ細胞の遺伝子発現は、“従来と違う”顔つきです。ＳＴＡＰ実験中にそうした細胞が存在していたのですから、小保方氏は遺伝子発現の一風変わった細胞を作製した事は確かなことです。若山氏もその機能に興味を持ち追及しました。
しかし、その実験でつかった細胞にアクロシンが入っている事を知らずに、小保方氏は論文執筆をしてしまったということです。
ExtFig4aの蛍光図は、肝細胞であることをしめす緑色蛍光です。・・・the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice.
凝集塊は1０個位の細胞数にみえますけど、この位の数以下でないと胚には入らないような気がします。
スフィア塊は、写真からみると大きいものから小さいものまで、かなり幅があります。
>> 学さん
自家蛍光はいろんなスペクトルを出すので、緑色フィルターだけで見るのではなくて、赤色フィルターでも見ますね。因みにライブセルイメージングでは同時に多画面を見れるので、緑も赤も同時に確認されたら自家蛍光が混じってることだけはわかりますが、手記にある通り、小保方さんはキメラ成功前から若山研でライブセルイメージング実験をラボメンバーに手伝ってもらって自家蛍光確認も行っています。(86P)
実験の都合次第で自家蛍光の無いものだけを取り出すこともできるでしょうし、自家蛍光の混じっている細胞しか観察されず、加えて必要があるなら、緑色蛍光が本当に挿入マーカー遺伝子の蛍光であるかどうかは別の手段で確認できますね。
①挿入人工遺伝子の存在をPCRで確認する方法
②マーカー標的している目的のmRNA自体の存在をPCRで確認する方法
③目的のmRNAの発現結果であるタンパク質の存在を免染確認する方法
丹羽さんは取り混ぜてすべて行っていますね。
自家蛍光の存在は蛍光顕微鏡を見るときの初歩知識で、関連の専門家ならだれでも知っています。STAP細胞の緑色蛍光を自家蛍光だと最初にいいだしたのがノフラーさん、日本では関さんですが、若山さんの人脈ですね。ノフラーさんのブログで、誰かさんがハアイ、ポールと呼び掛けて問答があるのですが、対してTs.Markerさんの<やっぱりね>質問はガン無視されていることはご承知のとおりです。
>> ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。
ここは自家蛍光もあったかどうかは確認写真がありませんが、ただ、自家蛍光の無いものを使っているということでしょうね。アルブクレマウスですね。僕の勘違いは後で述べます。
>> ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。
これはFigure3-aのことをおっしゃってるのだと思われますが、コントロールのES細胞ではCAG-GFP遺伝子と内在性Oct4遺伝子の発現量がそれぞれ1に設定してあり、赤と緑の棒グラフで示されていて、それに対して、GOFマウスの肝細胞を乖離した時点で既にOct4-GFPが対数スケールで7%程度発現している。ATP処理しても8%程度、HCL処理すると10%に近いという結果ですが、それに対する内在性Oct4遺伝子の発現は検出限界のゼロです。つまりGFPは光ってるが肝心の内在性Oct4遺伝子の発現はほとんど無いと言ってるわけですね。
これはqPCRの検証でmRNAそのものを検出しているのでもちろん自家蛍光の問題なんかとは無関係です。Oct4-GFP人工遺伝子は発現しているが、内在性のOct4蛋白質を作る遺伝子そのものは発現してないという結果ですね。丹羽さんはそのGFPの異常発現をleaky expressionと言ってますが、原因には触れていませんね。
Oct4-GFPの設計は内在性のOct4遺伝子を動かすためのプロモーターと同じものをGFP製造プログラムにつなげていますから、一方が動き出したら他方も動く仕込みです。でも生体の中でのことですから、酸浴亜致死下では双方の発現がどうなるかまでは考えられていませんよね。