上記は以前に紹介した丹羽論文ですが、この論文の一番大事な部分を書き出してみました。
ハーバードの再現実験では、Oct遺伝子の質がSTAP細胞とは違っていました。こうした細かい違いを一般人がフォロウするのは難しいです。一方、丹羽論文では、そこが分けて論じられています。
この論文で大事なのは、
Oct遺伝子が、もともとで持っている遺伝子と、人工的に挿入された人工Oct遺伝子とを、分けて論じていること。
研究者レベルの読者であれば、当然、説明文脈から理解できるのでしょうが、一般人でもこの違いを理解できるようにと、丹羽氏は配慮したのではないでしょうか？
この論文の結論として、STAP論文で報告したような酸浴後細胞の多能性は証明できないとなっています。
しかし、丹羽論文は、あくまでキメラ形成能を含めての多能性達成を目指しています。
キメラは若山氏の作製なのですから、理研の行った再現実験は、小保方氏、若山氏参加でやるべき質のものであったものが、実際にはそのような方向で実験計画を作れなかったわけです。
研究者層後の思惑の違いが、再現実験失敗の悲劇を生んだのですが、この時、理研研究者の価値観として、
「STAP細胞は再現できない！」と、どのような立場の研究者と言えど、高らかに宣言することが求められたのではないか？と思います。
そうした雰囲気の中で、STAP細胞の万能性は無いと書かれた論文の主要な部分が、酸浴により細胞は凝集しOct遺伝子が発現するとしたこの論文の意味は大きいものです。
そうした立場にたち、酸浴させた細胞が凝集し、Oct遺伝子をタンパクレベルで証明できた事実を、論文から読み取ってください。
以下の部分が、丹羽論文で一番大事な部分ですが、論文ではここが一番大事であることがわかりにくくなっています。
しかし、反ES論者にとっては、とても大事な部分で、特許申請もここを論拠として、現在も作業が続けられています。
We next performed qPCR on individual cell aggregates isolated from culture. Aggregates were selected and RNA samples were prepared separately. These RNAs were reverse-transcribed and qPCR was performed. We found that some aggregates expressed a comparable amount—more than 10% of the expression level in ES cells—of pluripotency-associated genes, including Oct3/4 (Fig. 3b). Since the cell aggregates consist of ~10 cells, such expression level indicated possible existence of the cell(s) expressing pluripotency-associated genes at the equivalent level to that in ES cells. Klf4 expression was detected in all samples, which may reflect its expression in liver cells, and thus serves as a positive control in this assay. Of cell aggregates derived from liver cells treated with ATP, 19% expressed the amount of Oct3/4 comparable to ES cells (Fig. 3c). These data suggest that some proportion of cells in the aggregates express pluripotency-associated genes at comparable levels to those of ES cells.
次に、培養物から単離した個々の細胞凝集塊に対してqPCRを行った。凝集塊を選択し、RNAサンプルを別々に調製した。これらのRNAを逆転写し、そしてqPCRを実施した。我々は、いくつかの凝集壊が、Oct3 / 4を含む多能性関連遺伝子を同程度の量（ES細胞における発現レベルの10％以上）で発現することを見出した（図3b）。細胞凝集体は約10個の細胞からなるので、この発現レベルは、多能性関連遺伝子を発現している細胞がES細胞と同等のレベルで存在する可能性を示唆していた。 Ｋｌｆ４発現は全てのサンプルで検出されたのは肝細胞である事を反映している可能性があり、陽性対照とした。 ＡＴＰで処理した肝細胞由来の細胞凝集塊のうち、１９％がＥＳ細胞に匹敵する量のＯｃｔ３ ／ ４を発現した（図３ｃ）。これらのデータは、凝集細胞が多能性関連遺伝子をES細胞に匹敵するレベルで発現することを示唆している。
To examine the proportion of the cells expressing Oct3/4 in the aggregates, we next applied immuno-staining using a specific antibody against Oct3/4 we raised and assessed previously15. Cell aggregates derived from low-PH treated liver cells were fixed, stained by anti-Oct3/4 antibody, and observed using confocal microscopy. We stained morula-stage mouse embryos as positive controls. By comparison with these positive controls, we found that some of the cell aggregates contained cells expressing Oct3/4 at comparable levels (Fig. 4a). In the case of cell aggregates derived from liver cells treated by ATP, 20% of cell aggregates contained Oct3/4-positive cells (Fig. 4b), which is consistent to the proportion of cell aggregates expressing the amounts of Oct3/4 comparable to ES cells detected by QPCR (Fig. 3c).
Oct3 / 4を発現する細胞塊の割合を調べるために、Oct3 / 4に対する特異的抗体を用いて免疫染色した15。低PH処理肝細胞由来の細胞凝集体を固定し、抗Oct3 / 4抗体で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。陽性対照として桑実胚期マウス胚を染色した。これらの陽性対照と比較して、細胞凝集体のいくつかがOct3 / 4を発現した（図4a）。 ATPで処理した肝細胞由来の細胞凝集体の場合、20％がOct3 / 4陽性細胞を含んでいた（図4b）。
In contrast, cell aggregates derived from liver cells treated by HCl included Oct3/4-positive cells at a frequency comparable to that of non-treated cells.
The presence of Oct3/4-positive cells in the cell aggregates found only 1 in 14 cases in cultures of non-treated liver cells suggests that such cells are derived from Oct3/4-positive cells present in the liver cell population, that in vitro culture may itself be a source of the stress to the cells, or that the immuno-staining technique may produce some non-specific signal. In cell aggregates derived from ATP-treated liver cells, the Oct3/4-positive
対照的に、ＨＣｌで処理した肝細胞由来の細胞凝集塊は、Ｏｃｔ３ ／ ４陽性細胞は、未処理細胞と同程度であった。酸浴のない肝細胞でも14凝集塊の１つにOct3/4陽性であり、肝細胞にOct3/4陽性細胞がいた理由は、培養自体が細胞へのストレスになっていたか、免疫染色技術上での非特異的なシグナルかもしれない。
さて、この実験では、自家発光か？そうでないか？がずいぶんと議論されましたが、丹羽論文ではGOFマウスは、自家発光しやすい欠点があると書いています。
その部分を読んでみましょう。
In the original report, the authors used transgenic reporter gene expression as a marker of pluripotency1. This reporter consisted of the transcriptional regulatory element of Oct3/4 and the fluorescent marker GFP, designated GOF, which is silent in somatic cells and activated in pluripotent cells14. When we used the same transgenic mouse line as a source of dissociated cells, we found that they began to acquire strong auto-fluorescence in culture after ATP treatment. On observation with fluorescent microscopy, most aggregates showed both green and red fluorescence, a sign of auto-fluorescence (Fig. 5a) although this may also include the fluorescent signal from the GOF transgene, since we detected Gfp mRNA by qPCR in these cells after culture in vitro for seven days (Fig. 3a).
元の報告では、著者らは多能性のマーカーとしてトランスジェニックレポーター遺伝子発現を使用した。 このGOFと呼ばれるレポーターは、Oct3 / 4の転写調節エレメントと、蛍光マーカーGFPから構成されています。体細胞ではOct3 / 4の転写はなく、多能性細胞では活性化されます。 同じトランスジェニックマウス系統を実験に使用すると、ＡＴＰ処理後、強い自己蛍光し始めました。 蛍光顕微鏡では、ほとんどの凝集塊で、緑色と赤色の両方の蛍光、つまり、自己蛍光の徴候を示しました（図5a）。しかし、７日間培養細胞において、GOF 導入遺伝子の mRNAをqPCRでは検出できることから（想像すると 英文ではmay）、GOF導入遺伝子からの蛍光シグナルも含まるだろう。（図３ａ）。
In cell aggregates derived from ATP-treated liver cells, the Oct3/4-positive cells were typically positioned in the center of the cell aggregates and exhibit large nuclei, and were surrounded by Oct3/4-negative cells with small nuclei at the peripheries of the cell aggregates (Fig. 4c).
ATP 処理肝細胞由来凝集塊において、Ｏｃｔ３ ／ ４陽性細胞は、典型的には細胞凝集体の中心に位置し、大きな核を示し、その周囲に小さな核を有するＯｃｔ３ ／ ４陰性細胞に囲まれてい（図４ｃ）。
Specific detection of GFP fluorescence by fluorescence-activated cell sorting (FACS) was also performed. In spleen cells collected using Lympholyte, CD45-positive/E-cadherin-negative blood cells were enriched. The reprogramming of such cells to a state of pluripotency can be monitored by their conversion to CD45-negative/E-cadherin-positive cells and acquisition of GFP expression from the GOF transgene. However, although we again observed increased auto-fluorescence and some reduction of CD45 expression, neither a specific signal of GFP fluorescence nor an increase of E-cadherin expression was observed in the low-pH treated cells (Fig. 5b). Given these findings, we suggest that that there was no evident sign of reprogramming in low-pH treated spleen cells based on the expression of the GOF transgene.
ＦＡＣＳによるＧＦＰ蛍光の特異的検出をした。脾臓細胞から、CD45陽性/ E-カドヘリン陰性 リンパ球を集めた。 多能性状態への再プログラミングは、CD45陰性/ E-カドヘリン陽性細胞への変換と、GOF導入遺伝子からのGFP（緑色）によりモニターすることができる。 低ｐＨ処理後、ＣＤ４５発現のいくらかの減少を観察したが、自己蛍光が増加し、および、ＧＦＰ蛍光の特異的シグナルもＥ−カドヘリン発現の増加も観察されなかった（図５ｂ）。 GOF導入遺伝子では、低pH処理脾臓細胞における初期化の明白な徴候がない。