Because of the inability clone STAP cells from single cells, we must await future technical advancement to examine whether their dual-directional differentiation potential at the population level may reflect one totipotent state at the single-cell level or two different states of STAP cells coexisting (or fluctuating between them) in culture
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狸氏が、上記の記事の英文を楽しく解説してくれた。http://giveme5.hateblo.jp/
狸氏が、上記の記事の英文を楽しく解説してくれた。http://giveme5.hateblo.jp/
落語のようにオチ付きであるが、これを考えるのに、どの位の時間がいるのか？
いづれにしろ、才能の無い人では思いつかない文章だ。
狸さん、話題作りをありがとう。
確かに、この英文をグーグル訳に入れると、全然訳さず、とんでもない日本語になってしまうことがわかった。
グーグル訳は、英文の医学論文を、医学論文らしい日本語で訳す。
そのための秘密は、訳の参考となる専門用語に関連する周辺知識をさがし、それとふさわしい日本語言い回しも選ぶ仕組みにあるようだ。
今回は、主語の判断が難しかった・・・。
この訳の話題からはなれるが、学とみ子がレター論文の後半に書かれた英文を紹介したのは、大事なことを伝えたいと思ったからだ。
STAP研究が途上にあること、未知の部分が多いことを、上の英文は語っている。
今後、STAP細胞を単一の細胞として検索をしていった時に、STAP細胞がどのような初期化状態にあるのか？がわかるかもしれなかった・・・。
元の細胞の何がキメラの体細胞を構成することができたのか？
STAP細胞を単細胞とした場合、細胞1個単位で胎盤と胎児になれる能力を持つのか？
TS様細胞とES様細胞の別々の細胞のミックスなのか？
TS細胞と、ES細胞が分かれる時、遺伝子制御はどう変化するのか？
注入された胚盤胞が着床する時、胚が子宮の状態を見回すとしたら、その時の遺伝子発現はどうなるのか？
着床後の胚では、元の各細胞間で、陣地取り合戦はどうなるのか？
上記のように、単一細胞としてのSTAP細胞の検索と、集団としてのSTAP細胞の検索との２方向で、研究が進むのかな・・・。
集団としてキメラマウスの臓器を作っていく過程の研究において、元T細胞やB細胞由来STAP細胞でもキメラの体細胞になれるのか？
同時に、STAP細胞単離への努力も続くだろう。
STAP細胞は、元の細胞が何かがわからない。
CD４５のもろもろ細胞集団のままで、ESとされて研究が終わらされてしまった・・・。
学とみ子が落ち込んだところで、話題を変えていこう。
注入されたSTAP細胞が、T細胞やB細胞由来であったとする場合を考えてみる。
キメラマウスで運よく増殖できて体細胞となった際、それらの細胞のTCR（BCR）の再構成パターンはまちまちである。
キメラマウスを調べても、いろいろなTCR（BCR）パターンがでてきてしまえば確認はできない。
だから、査読者2氏のようなアドバイスになるのだろう。
単一のTCR（BCR）を持った細胞が、大規模に増殖でき、どこかの臓器を形成すれば、その臓器ではサザンブロッティングで証明できるのかも・・・？
普通に考えると、キメラマウスにおいては、ホスト細胞のTCR（BCR）パターンも混ざってしまう。
このホスト細胞のTCR（BCR）パターンも多様だから、もう、何がなんだか、わからなくなってしまうだろうなあ～。
どなたか、ご意見ありますか？
コメント（46）
免疫系の細胞を除く体細胞（以下、単に体細胞）にはTCR再構成は生じません。ですからキメラの体細胞にTCR再構成があったら、その再構成されたTCR遺伝子の由来は注入されたTCR再構成があったT細胞からなのです。再構成遺伝子のパターンはなんでもいいのです。注入されたT細胞の遺伝子構成パターンがわからなくてもいいのです。遺伝子配列にともかくTCR再構成が見られればいいのです。
ですからキメラ体細胞のTCR再構成の有無を調べようということになったのです。なかったわけです。あったらSTAP説が成立しますが、なくてもSTAP説の否定にはなりません。なにか他の理由でできなかったのかもしれないからです。
この議論は４年前のことです。ご理解できますか？
＞遺伝子配列にともかくTCR再構成が見られればいいのです。
それを、キメラマウスで証明するための方法についての議論です。
ため息先生なら、どんな実験の組み立てを勧めますか?
そこを含めて解説する事が必要かと－－－－｡
実験系であっても、生きたマウスのTCRパターンから、元ドナーTCR再構成パターンをどう探索するんですか?
以後、お返事次第で(読者が)混乱する内容であったりする場合は、先の議論は、ため息先生のサイトでお願いするかもしれません｡
解説は建設的にお願いします。
＞普通に考えると、キメラマウスにおいては、ホスト細胞のTCR（BCR）パターンも混ざってしまう。
普通ではありませんね。異常な考え方です。
ホスト由来の細胞については、当たり前ですが、Ｔ細胞以外の細胞にはＴＣＲ再構成は見られません。
一方、目印としてＴＣＲ再構成をもつ多能性細胞由来の細胞には全てＴＣＲ再構成が見られます。
つまり、キメラマウスのＴ細胞以外の細胞にＴＣＲ再構成があるかを調べればよいのですよ。
ドナーである多能性細胞のＴＣＲ再構成のパターンが複数であっても問題ありません。 ＴＣＲ再構成を確認する手法、ＰＣＲの原理が理解できていれば判るはずですが、、、
Nature論文で「改ざん」と認定された電気泳動の画像がどのような実験手法で作られたのか、理解してますよね？？？
キメラの尾っぽでも、どこでもいいから体細胞をとりだしTCR遺伝子の構成を調べるのです。具体的なTCR遺伝子構成の調査方法は、私は専門家でもないので知りませんが、できるわけで、行ったのでしょ？その結果、キメラの体細胞にはTCR再構成はなかったわけでしょ？
ここまで（１）は同意していただけますか？
TCR再構成のパターンは関係ないのです。本来（キメラでも）体細胞ではTCR再構成がないからです。「元ドナーTCR再構成パターン」はどうでもいいのです。どんな形でも再構成があればいいのです。あれば、その由来はTCR再構成のあった注入したT細胞にあるのです。つまり初期化されたT細胞が増殖分化してキメラの体細胞になったわけです。STAP現象の証明ができたことになります。
これ（２）は同意していただけますか？
（続く）
（続き）
方法の議論ではないです。ロジックです。学さんは注入したT細胞のTCR再構成パターンがわからないから、論理的にできないとおっしゃっているんでしょ？その意見はちがうと私は言っているのです。
実験の組み立ては専門ではないので実験方法を知らないから、当方にはできません。もし（実際にそうでしたが）TCR再構成が認められなければ、方法の議論をしてもいいです。（丹羽氏が解説したように）本来はあるべきなのに、検出できない理由を議論してもいいのです。しかし、その議論ではSTAP現象があったともなかったとも結論できないでしょう。
このホスト細胞のTCR（BCR）パターンも多様だから、もう、何がなんだか、わからなくなってしまうだろうなあ～。
「免疫細胞以外の体細胞」と「免疫細胞」を適切に分離できれば、「ホスト細胞の内の<免疫細胞以外の体細胞>」から遺伝子再構成を検出することは出来ません(機器の精度の限界は勿論あります)。
またそれらの適切な分離の上にしか、論文には採用されなかったとは言え、笹井氏が参加して以降の特許書類にも採用されている「2Nキメラの電気泳動図」も存在しえません。
ジェイコブ・ハンナの論文でも同様です。
ttps://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(08)00447-9
この「分離」の実施に関して、彼の論文に具体的直接的な記載があることを期待したのですが、そうはっきりしたものではなかったです。が、FACSソートで実現していることは十中八九間違いないでしょう。
マテメソに97%以上の精度があると書かれています。
＞ＴＣＲ再構成があるかを調べればよいのですよ。
だから、それをどうやって調べるか？ですよ。探索方法をご解説ください。
例えば二種類の免疫系に特異的な抗原を利用し(論文の別の実験では、ダヴル陽性細胞などが頻繁にあられます)、二回に分けて(か、同時に出来るのかも実地の実験経験がないので分からないですが……)、ソートを実施したとして、(3/100)^2で、9/10000≒1/1000の精度です。1000個に1個しか免疫系細胞は混じりません。
実験系の正当性を担保するに十分です。
ジェイコブ・ハンナの論文で、具体的直接的に記載されていないのは、恐らくあまりに常識的過ぎるからでしょう。
ハンナさんの論文のセルラインやキメラのサザンの図からの考察を書き込んでください。
そして、他の方にも2008年のハンナさんの論文を読むように勧めてください。
他の方も、STAP実験との違いが理解できると思います。
多くの人が認めるSTAP論文に於ける<リプログラミングの証明論>では、STAPの元細胞とキメラアッセイでキメラ寄与した体細胞(細分化後は免疫細胞以外)の同一性証明は不要なのです。
それは、「単一細胞に乖離して培養系で増殖/維持させることが出来なかった」STAP細胞の特徴をポジティブに汲んだ結果です。
まあ、立論者によるものなので当然と言えば、当然ではあります。
このレフリーの指摘を理解していたら、なぜ、著者らがこの図をとりさげたかの理由もわかるのと思います。
簡潔にまとめれば、STAP細胞には増殖能はなかったので、その事実を事実として真摯に受け止めれば、サイエンスの「査読者２」の査読は常識的な擁護派(具体的に誰なんだ？、とツッコまれると困りますが……最後の砦はJISAIさんだけになってしまったようなので(^^A)には、無理難題を押し付ける過剰なイチャモン査読に写っていると思います。
学さんのユニークな点は……内緒話にしませんか？。
ツイッターには「ダイレクトメール」という機能が付いていて、内緒話が出来ます。そっちは文字数制限はないですよ(^^A。
＞だから、それをどうやって調べるか？ですよ。探索方法をご解説ください。
Nature論文のMETHODに書いてある方法（TCR-b chain gene rearrangement analysis.）で調べればよいでしょ。
STAP細胞ではFig1.iのように「TCRパターン？が個々に違う」ので、ラダーのようなバンドになってますが、仮にそのうちの１つのSTAP細胞がキメラに寄与した場合には、そのラダーの中のどれかがバンドとして見えるでしょうし、複数のSTAP細胞が寄与した場合には複数のバンドとして見えるでしょうね。
さっそくのコメントありがとうございます。
＞キメラアッセイに利用することは出来ませんでした。
だから、STAP特許の図では、たとえ、元のT由来細胞があってもPCRゲル図ではそのTCRはみえない。
＞同一性証明は不要なのです。
同一TCRを証明するというのではなく、同一TCRでないと、ゲル図で見る事ができないからです。
ハンナさんは、B-iPSにおいてBCR遺伝子切り取り状態(再構成)を単一化させたセルラインを使っています。複数のセルラインを作って、それぞれのセルラインBCR遺伝子ごとに、ゲル図を展開させています。ここを揃えないと、ゲル図でラインが多すぎちゃいます｡特許図のように｡
携帯にて作文しており、説明不足ですみません。
簡潔にまとめれば、STAP細胞には増殖能はなかったので、その事実を事実として真摯に受け止めれば、サイエンスの「査読者２」の査読は常識的な擁護派(具体的に誰なんだ？、とツッコまれると困りますが……最後の砦はJISAIさんだけになってしまったようなので(^^A)には、無理難題を押し付ける過剰なイチャモン査読に写っていると思います。
学さんのユニークな点は……内緒話にしませんか？。
ツイッターには「ダイレクトメール」という機能が付いていて、内緒話が出来ます。そっちは文字数制限はないですよ(^^A。
だから、STAP特許の図では、たとえ、元のT由来細胞があってもPCRゲル図ではそのTCRはみえない。
ttps://twilog.org/aruimiouji/nomen
特許図はこちらが元になっていますので、こちらを載せます。
TCR再構成を示すバンドは写っています。
これなしに吉村先生の立論はあり得ません。
>ここを揃えないと、ゲル図でラインが多すぎちゃいます｡特許図のように｡
一つのレーンに複数写っているバンドのことを言っていますか？。
僕は尻尾を十本もまとめてPCRに掛ける前の下処理をすればいいと、吉村説には取り敢えずの反論をしています。但し、「キメラ1」「キメラ2」という表記がそれぞれ一匹のキメラマウスを表すのなら、的外れな「原理論的な批判」に過ぎなくなりますが。
キメラはかなりの数があったと推定できます。
2018/5/20(日) 午前 10:55 学とみ子
でも、もし、何らかの別の方法で、元のマウス由来T細胞が確認できたら、遺伝子の一部が切り取られた細胞が生き残り、遺伝子欠損のまま増殖し、かつ次の生き物になれるというすごい発見になりますね。そう思いませんか？
2018/5/20(日) 午前 11:44 学とみ子
TCR再合成の無いマウスは生まれない（胎内で淘汰、流産する）と考えるのが普通ですけどね。
2018/5/21(月) 午後 1:29 学とみ子
もし、遺伝子が切り取られたT細胞で、キメラ部分が構成されていたら、元マウス由来T細胞がその部分を作ったことになり、4Nだったら全胎児を作ったことになりますね｡
こうしたマウスは生まれてこないと考えます｡
2018/5/21(月) 午後 10:10 学とみ子
DNAが切り取られたT細胞は、（周囲環境が変わり）抗原刺激がない状態では使い捨て細胞とし
「他の方にも2008年のハンナさんの論文を読むように勧めてください。」とのことですが、、
そもそも、aruimioujiさんがハンナ論文を持ち出した目的は、上記のような「TCR再構成のある多能性細胞からキメラマウスは生まれない」という学さんの出鱈目な考え方に対する反証だったはずですが、、
学さんは本当にハンナ論文を読んで、この点について理解されたのでしょうか？
「TCRやBCRの遺伝子再構成のある多能性細胞を用いてもキメラマウスは生まれる」ということと、
「単一のTCR再構成パターンを有する多能性細胞か、複数のTCR再構成パターンを有する多能性細胞か」の相違は、基本的に無関係であることは理解できていますか？？？
＞例えば二種類の免疫系に特異的な抗原を利用し(論文の別の実験では、ダヴル陽性細胞などが頻繁にあられます)、二回に分けて(か、同時に出来るのかも実地の実験経験がないので分からないですが……)、ソートを実施したとして、(3/100)^2で、9/10000≒1/1000の精度です。1000個に1個しか免疫系細胞は混じりません。
実験系の正当性を担保するに十分です。
タブルポジティブというのは、2種類のBCRがでる事があるという意味ですか？
BCRは分化の過程で、細胞表面に表出するBCR蛋白の種類を変化させていきますよね。その過程で、二種類のBCRが出るという意味でしょうか？
いづれにしても、キメラ臓器に浸潤するホストB細胞の率が低いはずという話なら、それだけではバンドの複雑性は説明がつきません。
ハンナさんの実験では、キメラ臓器を構成する元B細胞のBCRを揃えているからこそ、きれいなBCRのバンドが出ます。ハンナさんのキメラマウス全体が、単一BCRのB－iPSとホスト細胞で構成されています。単一BCRを持つ細胞から臓器が構成されているので、バンドがクリアです。
STAP実験の場合は、尻尾細胞に寄与したT細胞のTCRは元から多様ですから、バンドが無数に出てしまいます。そこにさらに、ホスト細胞のTCRも混じります。
BCRは分化の過程で、細胞表面に表出するBCR蛋白の種類を変化させていきますよね。その過程で、二種類のBCRが出るという意味でしょうか？
こんな質問したらピラニア軍団大喜びです。
悪いことは言いません、ツィッターで内緒話を一杯しましょう。
申し訳ないけれど、その中で大分学んで貰わないと。
ごく基本的なことなので、検索エンジンという凄い武器が現代にはあるので、自分で調べて下さい。
ttps://www.abcam.com/protocols/fluorescence-activated-cell-sorting-of-live-cells
FACSによるセルソーティングの良く出来た概要です。
ジェイコブ・ハンナのその部分のマテメソは読みましたか？。
まだ「免疫細胞とその他の体細胞の分離」が不十分で実験系がそもそも成り立たないと考えていますか？。
そんな研究者は誰もいないと思います。
ちょっとでもこの分野を理解していたなら。
学さんが「分離不可能説」に立つのなら、ジェイコブ・ハンナの該当図表はどう理解されているのでしょうか？。
単一細胞から始まっても、原理的分離不可能性の中で立ち往生しますけれど……原理的に保証された混合率ということで、実験の正当性が担保されるのでしょうか？。
そんなふうに考える研究者は誰もいないと思います。
免疫学のダブルボジティブというのは、いろいろあると思いますが、何のことを言っていますか？
ピラニア軍団は、TCRを理解していません。もう相手にするのはやめようと思います。
恐らくあなたも、十分に理解しているのかどうかは、私にはわかりません。
TCR、BCRが動物の中で非常に多様に存在していることを理解しているのでしょうか？
＞「免疫細胞とその他の体細胞の分離」が不十分で実験系がそもそも成り立たないと考えていますか？。
そんな研究者は誰もいないと思います。
「免疫細胞とその他の体細胞の分離」についてなど、一言も言ってませんよ。ファックスを使えば、CD４、CD８で、T細胞を分けられるとかの話なのでしょうか？
もしかすると、私の言っていることの大きなところであなたの誤解があると思います。たとえば、人の末梢血には、T細胞、B細胞がありますが、そのTCR,BCRパターンは皆違うのですが、そこのコンセンサスは大丈夫でしょうか？
あなたが、ツイッターで学とみ子が酷いというと、ピラニア軍団が大喜びするので、できれば止めて欲しいです。
あなたが、学とみ子をへし折りたいなら、どうぞ、攻撃なさってください。
短い言葉しか発せずして、相手がすべて理解すると思わないでくださいね。
私たちは、お互いに立場も、知識を得てきた環境についても知らず（何を良く知っていて、何を知らないかが、お互いにわからない）者同士ですから、それをふまえて議論する必要があります。
私は科学実験はしていないし、ファックスの経験もありません。私は、論文に出てきた結果をみてものを言っているだけで、実験の方法論は知りません。
人の病気を考える上で、必要だと思うので、基礎医学の論文も読むだけの人です。
その私が、STAP論文の潰し方が理不尽だと思うので、このブログを書いています。
この技術を使うのに、細胞の表面に現れる抗原とそれに結合する抗体を利用した、「免疫蛍光染色」という細胞生物学では余りにも良く知られた基礎的な技術が用いられます。
免疫蛍光染色についてのリンクです。
ttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/imaging-basics/labeling-your-samples/immunolabeling.html
いづれにしても、キメラ臓器に浸潤するホストB細胞の率が低いはずという話なら、それだけではバンドの複雑性は説明がつきません。
細胞の浸潤というような話は一切していません。
FACSによるセルソーティングです。
STAP特許に於ける「2Nキメラ」の電気泳動図や、ジェイコブ・ハンナのB-iPS由来キメラのサザンブロット図の正当性を担保するための重要な下処理です。
兼ねてから学さんは、「免疫系細胞とそれ以外の体細胞の分離不可能性」を説いてますよね？。
それがごく単純な間違いであると指摘しています。
ジェイコブ・ハンナ論文のマテメソ、「Flow Cytometry Analysis and Cell Sorting」には、例えばCD19とCD220が載っています。
ttps://en.wikipedia.org/wiki/CD19
ウィキでは『CD19は、形質細胞に分化までB細胞の開発の全ての段階において広く表されます』とあります。
「CD220」はCD45の異名です。
この2つの抗体を用いて2回セルソーティングを行えば、3/100×3/100=9/10000≒1/1000で、学さんの心配している「普通に考えると、キメラマウスにおいては、ホスト細胞のTCR（BCR）パターンも混ざってしまう。」は杞憂に終わります。
ホスト由来の免疫細胞も、ドナー由来の免疫細胞も実験を擾乱するノイズですが、それらを1/1000の割合にまで締め出すことが出来るからです。
またホスト由来の「免疫細胞以外の体細胞」に遺伝子再構成がないのは自明です。
実験の正当性を担保するのに十分です。
「Flow Cytometry Analysis and Cell Sorting」
The following fluorescently conjugated antibodies were used for FACS analysis and cell sorting: anti-SSEA1 (R&D systems), anti-Igκ, anti-Igλ1,2,3, anti-CD19, anti-B220, anti-c-Kit, anti-CD25, anti-sIgM, anti-sIgD (all obtained from BD-Biosciences). Cell sorting was performed by using FACS-Aria (BD-Biosciences), and consistently achieved cell sorting purity of > 97%.
最初に、京大（当時は横浜理研）の河本先生の、胎児胸腺細胞におけるTCRb再構成追跡の論文
ttp://www.jimmunol.org/content/jimmunol/179/6/3699.full.pdf
を見て下さい。Double negative (DN) T細胞の培養系を用い、TCRb再構成の多様性を追跡しています。DN1やDN2の細胞を、シングルセルから培養して増やすと、その間にTCRb再構成がランダムに起き、多様な再構成パターンが見られる事が、PCRを用いた網羅的なD1J1及びD2J2の再構成検出により示されています。「ポリクローナル」な細胞集団の多様な再構成パターンを、PCRである程度 網羅できる事を示しています。PCRの場合、増幅サイクルを増やしたり、増幅プロセスを２段階にする事により、 再構成されたTCRが１コピーでもあれば検出可能（理論的には）ですから、モノクローナルである必要はないです。