2018/2/21に stemness さんから以下のコメントをいただきました。青字
ありがとうございました。
ありがとうございました。
小保方methodでは小ハサミで粗分離した後、事前に用意されたパスツールピペットの先端を焼いて伸ばした細管の中に細胞塊を通して分離させることを”強く推奨”しています。(STAP HOME PAGE参照)
両者は後に細胞ストレーナに通しますが、小保方さんの方は細胞ストレーナ分画に伴う表面張力が生まれる弊害を無視するような粗っぽい操作はしていません。
細管に通すコツはSTAPの肝であって酸浴の前に物理的刺激により細胞たちにある程度の初期化認識の決断を加速させる下準備も含んでいるのかも知れません。小保方さんの理研UL採用時、西川先生が驚愕したプレゼン発言「生への欲求は生物の本能である」の第一段階。
>Obokata et al記載のプロトコールに従って低pH培地で処理した。
酸浴細胞を低pH培地で処理するなら細胞はいずれ死滅します。何の為に37度C25分酸浴インキュベートしたのか意味を持ちません。第一リン酸Na、第二リン酸NaでpHや浸透圧調整されたPBSを含むbFGF溶液を使う以上、酸浴後の培地のpHは上清液を除き新たに加えた液体培地は中性領域pH7.4辺りだと考えます。Tang論文は上清液のpHが5.7の値をしつこく確認しただけの無意味そのもので、それからもずっと低pH培地で処理したかの如く誤解を招きます。
＞脾臓細胞は、7日目まで終えていない原因は不明です。
考えられるのは、obokata et al.のマテメソから酸浴に至る過程の時間的記述が分からないので条件を変えて1-7日の期間を考えたのでしょうか。
脾臓細胞に7日がないのは死滅した可能性がありデータとして残せないかもです。
そもそも酸浴前に7日空ける実験計画なんてナンセンスですよ。考え方によっては、もし小保方 methodで細管を通すのが肝ならば、細胞たちが危機意識を感じて初期化の準備のステータスが日が経てば経つ程、安心して起点に戻ることになります。小保方さんなら即酸浴するでしょう。小保方methodにない細胞分画の粗っぽさや培地選択にも両者には厳密には違いがあり追試に疑問符が付きます。マテメソから手技の隠れた意味合いを読み取れていないなら追試の難しいところでしょう。細胞の初期化は酸浴前の準備段階から繋がって構想されていると想います。
Tang追試実験結果のデータの列挙は、もっともらしく見えても実は雑に感じます。STAP追い討ちの印象しか感じません。
学とみ子は、現在、ネットにアップされている小保方著なるプロトコールエクスチェンジをもう一度見てみました。
まず、“細胞の取り扱い方、培養条件、最初の細胞の選択に細心の注意を要する”とあります。
酸浴後1日目は、細胞は生存している（１日以内には死なない程度の酸浴条件）。
２－３日後では８０％が死滅する。（この程度のストレス条件をかけることが必要で、強くても、弱くてもだめ）
上記の死滅の条件を満たすには、酸性条件に限定されるのではなく、多因子が関与する。
例えば、酸浴前後の細胞の扱い方法の影響を受けるし、使用する細胞の元が培養細胞であったらSTAP転換はしないだろう。
取り出した組織は、パスツールピペットでバラバラにするか、トリプシンやコラゲナーゼなどの酵素を使用し細胞同士を単一細胞レベルとする。
リンパ球に、赤血球が付着しているとリプログラムしにくくなり、細胞マトリックスの付着も効率を低下させる。
CD４５抗体をつかってFACS Ariaでソートする。
これをやらないとリプログラムはしやすくなるが、細胞のアイデンティティがあいまいになる。
私たち（小保方ら）の使ったマウスは、理研で維持されているトランスジェニックマウスGOF18-GFP line11でホモでトランスジーンを保有しているものであった。
（これでなければダメとは書いていない）
マウスは１週令を超えると、リプログラムしにくくなる。オスの方が効率が良い。
HBSSの緩衝性は弱いので、４℃であらかじめ冷却したHBSS４９４μに細胞ペレットを浮遊させ、希釈HCL液６μ（590μのHBSSに35%HCL10μ）を加える。あるいは、PH5.4のHBSS液に細胞ペレットを浮遊させる。
PHが5.7であるように予備的にHCL量を調整し確かめる。酸浴後、室温1000回転で5分遠沈をする。
HBSS浮遊細胞中の細胞生存状態は、注意すべきポイントであり、酸浴後、日で大きな細胞死があるようなら、酸浴時間を15分にすると良いかもしれない。
酸性液を除いた後の細胞を、非接着性の培養プレート（DMEM/F12液に1,000単位のLIFと2%のB27）に置く。
接着性のプレートでは、細胞の動きを悪くして凝集塊の形成を悪くするかもしれない。細胞の数も大事で、10の５乗から６乗とする。
STAP細胞は、混合された細胞であり、単一細胞由来ではない。
”STAP細胞は、混合された細胞種であり、単一細胞由来ない。”
と書かれた部分は、興味深い。
細胞種が混じっているSTAP細胞から、単一細胞種であるSTAP幹細胞への転換はいかにして達成されたのか？について、ご意見やご教授があればコメントください。
また、実験系の手技についての誤訳がありましたら、ご指摘を賜りたいです。