mRNAワクチン設計における自己増幅

https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 RNAマシンの台頭 – mRNAワクチン設計における自己増幅

ハイライト:

mRNAワクチン設計の次のステップは1回の低用量免疫で長期にわたる体液性および細胞性免疫応答を提供するウイルスベースの自己増幅 mRNA (レプリコン) の適用です。

レプリコンは独自の複製機構をコード化し標的細胞への投与後すぐにコピー数を増加させます。

これにより必要な初期mRNA投与量が大幅に削減され結果として個人への副作用が軽減される可能性があります。

脂質または固体ナノ粒子を使用した mRNA 製剤の最近の進歩により粘膜送達などのレプリコンの新たな用途の機会が生まれています。

レプリコンワクチンは安全性の側面が適切に対処されればプラットフォーム技術としての可能性を秘めています。

多価癌ワクチンや治療用癌ワクチンなどの革新的な用途向けに多様なレプリコンが開発されてきました。

mRNA ワクチンの展望 今後の展望は?

合成mRNAワクチンは長年の基礎研究と前臨床研究を経て新型コロナウイルス感染症（COVID-19）パンデミックの際に華々しく登場しました。

mRNAワクチンは開発が迅速で細胞を使用しない製造（用語集を参照）https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 臨床効果が高いことから早期のワクチン承認をめぐる競争で従来の弱毒生ワクチン、不活化ワクチン、タンパク質ベースのサブユニットワクチンに勝ちました[  ] しかしmRNAワクチンの大規模な導入により高用量と副作用のバランスを取ること、プライムブーストワクチン接種の必要性、コールドチェーン保管の必要性などの課題も明らかになりました。これらの課題は自己増幅mRNA（レプリコンRNAとも呼ばれる）をベースにした次世代のmRNAワクチンによって克服することができます[  ]。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3mRNAワクチンは目的のタンパク質をコードしますがレプリコンは目的の遺伝子（GOI;トランスジーン）とレプリコンRNAの自己増幅を可能にするすべての必須要素をコードする分子シャーシとして設計されています。標的細胞でのレプリコンRNAの急速な増幅により目的のタンパク質（例：ウイルス（糖）タンパク質）の発現が増加し（図1 https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 従来のmRNAワクチンよりも大幅に低い初期RNA量で防御免疫応答が誘導されます[ https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3ます。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 このレビューではヒトと獣医の両方の用途で最もよく研​​究されているアルファウイルスとフラビウイルスベースのレプリコンに焦点を当てています。[ 5、6 ウイルスの構造遺伝子がトランスジーンに置き換えられているためレプリコンRNAは環境中に拡散することができず、これがキメラウイルスワクチンや組み換えウイルスワクチンとの重要な違いである（1）https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3  

ボックス 1（ウイルス）核酸ワクチンの作用機序。mRNA: 試験管内で転写されたmRNAの構造は細胞mRNAと非常に似ており一般的に5'末端の7-メチルグアノシンキャップ アナログ5'および3' 非翻訳領域 (UTR)目的遺伝子 (GOI)およびポリアデノシン (ポリ A) テール (図 I A) で構成されています。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 ワクチン接種の目的でmRNAを最適化するためにベクターの安定性、翻訳効率、または免疫原性を高めるための変更が適用されています。これらの核酸ワクチンはGOIのみをコードしているため近隣の細胞で複製したり近隣の細胞に拡散したりすることはできません。レプリコンRNA:レプリコンRNAはinvitroで転写された mRNAに似ていますがウイルスのレプリカーゼ遺伝子もコードしています。これらの遺伝子によりmRNAが急速に増幅され非増幅 mRNA と比較してGOIの産生が増加します。自己増幅ウイルス遺伝子はアルファウイルスやフラビウイルスなどのウイルスに由来します (図 I B)https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 アルファウイルスベースのレプリコンにはすべてのレプリカーゼタンパク質をコードするGOIの上流に分離されたオープンリーディングフレーム (ORF) が含まれています｡対照的にフラビウイルスベースのレプリコンではこれらのレプリカーゼタンパク質はGOIの下流の単一のORFにコードされています。レプリコンRNAはすべてのアルファウイルスまたはフラビウイルスの構造タンパク質をコードしていないためRNAは増殖不全です。そのためレプリコンRNAワクチンは非増幅mRNAワクチンと同様に合成核酸ワクチンに分類されます。キメラウイルス:レプリコンRNAワクチンと同様にキメラウイルスワクチンは異種ウイルス病原体の防御抗原を発現するために使用されます。キメラウイルスのゲノムは独自のレプリカーゼをコードしていますがワクチン接種時にこれらの構造タンパク質に対する防御免疫応答を誘導するために構造遺伝子が異種ウイルスの遺伝子に（部分的に）置き換えられます。ウイルスの構造遺伝子とレプリカーゼ遺伝子の両方が維持されるためレプリコンワクチンの非増殖特性とは対照的にウイルスの増殖が観察されます。

したがってキメラウイルスワクチンは生ウイルスワクチンに分類されます（図 I C）https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 最近のキメラアルファウイルスワクチンの研究では昆虫に限定されたエイラットウイルスをベースにした安全なキメラアルファウイルスワクチンプラットフォームの開発に焦点が当てられました。エイラットウイルスの構造遺伝子はVEEV、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルスなどの高病原性アルファウイルスの遺伝子に置き換えられました[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 フラビウイルスについては十分に研究され弱毒化されたYFV17D株を用いたキメラワクチンの生産が成功裏に実証された。この株は異種のウエストナイルウイルス、DENV、および日本脳炎ウイルス（JEV）の構造遺伝子を発現するように改変された。DENVまたはJEV構造遺伝子に対するYFV 17Dワクチンベクターはヒトへの適用が承認されている[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 組み換えウイルス:キメラウイルスワクチンと同様に組換えウイルスワクチンは外因性GOIを発現するように改変されたウイルスゲノムに基づいています（図ID）https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3しかしキメラウイルスワクチンとは対照的に組換えウイルスはウイルスの複製とカプシド形成/伝播のためのすべての遺伝子をコードしています｡アルファウイルスベースのレプリコンプラットフォームは多くの用途がありますが完全なアルファウイルスゲノムの細胞変性特性により組換えウイルスワクチンとしてはあまり好ましくありません。対照的に組換えフラビウイルスワクチンは免疫療法として、または細菌性またはウイルス性感染症に対する予防に使用するのが現実的であると考えられてきました[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3それにもかかわらず水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルスなどの他のウイルスは組換えウイルスベクターとして使用することがより頻繁に説明されており適切な代替手段となります[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 キメラウイルスと同様に組換えベクターウイルスは生ウイルスワクチンに分類されます。( 中略 ) 詳細はこちらをご覧ください。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 ワクチン登録に課題となる安全性の考慮:レプリコンワクチンの広範な商業的応用は病原体制御戦略に影響を与える可能性がありますがレプリコン技術の可能性を最大限に引き出すにはワクチンプラットフォームとしての登録が必要です。ワクチンプラットフォームの概念は単一のレプリコンベクター、標準化された送達方法、およびトランスジーンを挿入してさまざまなレプリコンワクチンを生成するための明確に定義されたプロセスのライセンスに依存しており承認手順の一環として大規模な再評価は必要ありません。実際米国農務省（USDA）はアルファウイルスベースのベネズエラ馬脳炎ウイルス（VEEV、ワクチン株TC83）レプリコン粒子を獣医プラットフォーム技術（製品コード9PP0.00）としてすでに登録しており農家にカスタマイズされたレプリコンワクチンを迅速に提供できるようにしています[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 獣医プラットフォーム技術に関するEU規制は現在ワクチンの入手可能性を高めるために開発中です[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 獣医分野でのレプリコンプラットフォーム登録への信頼はヒトワクチン分野でも同様の手順を確立するのに役立つでしょう。最近インドの規制当局（中央医薬品基準管理機構；CDSCO）から初のヒトレプリコンワクチンが緊急使用承認を受けました。このCDSCO承認のVEEV-TC83ベースのレプリコンワクチンは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）スパイク遺伝子を発現しLNPにカプセル化されています（PD/Vacc-06のライセンス番号MF/BIO/22/000064） 10、52–54 アルファウイルスおよびフラビウイルスベースのレプリコンワクチンは他のワクチンが道を開いた今世界中で認可されると期待されています。USDA承認のVEEV-TC83レプリコンワクチンはすでに豚コロナウイルス（豚流行性下痢ウイルス）に対する数百万匹の動物の免疫化に成功しています[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 さらに生弱毒化キメラフラビウイルスベクターワクチンプラットフォーム（ChimeriVax）はオーストラリア、タイ、メキシコ、フィリピン､ブラジルで市販されています[  ]。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3このキメラ黄熱ウイルス（YFV）ベクターワクチンではYFVエンベロープ遺伝子が異種フラビウイルス遺伝子に置き換えられヒトの日本脳炎ウイルスおよびデングウイルス（DENV）に対する防御免疫を誘導します[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 キメリバックス生弱毒化ワクチンは依然として構造遺伝子をコードしていますがレプリコンワクチンはアルファウイルスやフラビウイルスの構造遺伝子をコードしておらず環境中に拡散することはないためより安全であると予想されます。これらの最近の成功にもかかわらずアルファウイルスとフラビウイルスのレプリコンワクチンの世界的な認可には依然として課題が残っています。現在世界認可に関わる主な課題はこれらのワクチンの複製特性に関する潜在的な安全性の懸念である。すべての自己増幅ワクチンと同様に脆弱な個人における有害事象に関する懸念が提起されている。例えばレプリコンワクチンはクリアランス効率が低下する可能性があるため免疫不全の個人では持続する可能性がある。もう一つの検討対象グループは妊婦であり特に先天性感染症を引き起こすウイルス（例：VEEVおよびYFV）由来のレプリコンベクターを使用する場合はそうである[ https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 とはいえレプリコンワクチンの投与経路として最も一般的な筋肉内注射は注射部位での局所分布を伴うためレプリコンRNAが胎児に拡散することはないと予想される。静脈内注射は全身分布を引き起こす可能性があるが胎盤https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3レプリコンの通過を妨げる[ 60、61  たとえレプリコンが胎児に広がったとしても弱毒化YFV17Dベクターワクチンで示されたように胎児の発育に影響を与えることはないと予想される[  ,  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 しかし脆弱な個人に対するレプリコンワクチンの実施を保護するためには追加の前臨床および臨床研究が必要である。最後にレプリコンワクチンが循環ウイルスと組み換える能力を考慮する必要があります。この潜在的な安全リスクは従来の生弱毒ワクチンと自然界のウイルスとの間で報告されている遺伝的相互作用に基づいています [  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 さらにアルファウイルスではいくつかの組み換えイベントが報告されていますが最も興味深いのは病原性西部馬脳炎ウイルスをもたらした2つの異なるアルファウイルス間の古代の組み換えイベントです [  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3  フラビウイルス間の遺伝的相互作用も報告されていますがこれらが発生する可能性は低いです [  ,  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 それでも組み換えの発生率が低いと考えられている場合でもレプリコンワクチンを広く配布する前にそのようなイベントの影響を評価する必要があります。粘膜を標的とするレプリコン:粘膜組織における局所免疫応答が広範囲の病原体に対する防御に重要であることがますます明らかになっている[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 ウイルス性病原体の大部分は呼吸器、胃腸管、泌尿生殖器などの粘膜表面から宿主に侵入するため粘膜ワクチン接種はより注目に値する。現在進行中のSARS-CoV-2パンデミックではワクチンは直接筋肉内注射で投与され十分な粘膜免疫を付与することなく全身の細胞性免疫と体液性免疫に重点が置かれています[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 そのためウイルスの侵入と排出を減らすという潜在能力は十分得られていません。https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 過去には主に生弱毒化ワクチンの粘膜送達に焦点が当てられていました。これはポリオウイルス[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 インフルエンザAウイルス[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 ロタウイルス[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3を含む一連の病原体に対して効果的な免疫応答を示したためです。しかし生弱毒化ワクチンに伴う毒性回復のリスクと明確に定義された粘膜アジュバントの欠如により粘膜投与経路の探索は遅れていました。後者は主に自己アジュバントレプリコンワクチンが取り組むことができるものです。治療用VEEV-TC83レプリコン粒子による鼻腔内ワクチン接種に関する最近の研究ではレプリコンRNAの効果的な送達と目的のタンパク質（抗SARS-CoV-2中和抗体）の長期発現によりウイルス感染の発症を防ぐことができました[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3それに加えてRNAワクチンのリポソーム製剤とLNPカプセル化の最近の進歩、およびこれらの分子が粘膜組織に取り込まれる傾向によりレプリコンRNAの応用に新たな機会が生まれています[ https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3

の場合は鼻スプレー、家畜の場合は水や飼料を介して投与することが可能になります。[ 86 https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3 レプリコンの未来と未来のレプリコン:レプリコンベクター技術は常に進歩しています。最近の開発の1つは2部レプリコンベクターシステムの確立です[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-31部レプリコンは自己増幅遺伝子とトランスジーンを1つのRNA鎖にコードしますが2部レプリコンはトランス増幅RNAから目的のタンパク質を発現します。これは狂犬病ウイルスの糖タンパク質などレプリコンベクターを1部システムにパッケージ化する可能性のある目的のタンパク質に対して安全上の利点をもたらします[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3さらにこのモジュールシステムによりレプリコンベクターの事前生成と目的のタンパク質の可変RNAの迅速なオンデマンド生成が可能になります。翻訳を阻害するレプリコン誘導性インターフェロン活性化を低減することによりレプリコンベクターの効率を向上させるための新しい戦略が検討されている。ワクシニアウイルスE3Lタンパク質（Merck/Sigma–AldrichのSimplicon発現プラスミド）や中東呼吸器症候群コロナウイルスORF4aタンパク質などの要素が自然免疫認識を回避するためにVEEV-TC83ベースのレプリコンに挿入されている[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3これらの要素は非線形用量依存性を軽減し免疫原性を高めることができることが実証されている。しかしそのようなレプリコンを含む推定組換えイベントはレプリコンが由来する野生型ウイルスよりも病原性の高いウイルスを生成する可能性があるため、そのようなレプリコンを意図的に環境に放出することを許可する前に厳格な安全性試験が必要である。他のいくつかの分野でも発展が見込まれています。まずmRNA分子の長さを短くするためにレプリコンの小型化が進められています。最も広く使用されているレプリコンは比較的長い8～9kbの遺伝子カセットでコード化された相互作用する複数の多機能タンパク質からなるアルファウイルスレプリカーゼに基づいています｡レプリコンRNA分子が短くなれば製造が容易になりRNA送達効率が向上し投与量が減りおそらく製造コストも削減されます。おそらくアルファウイルスレプリカーゼ内のすべての機能がRNAの自己増幅に必要なわけではありません[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3合理的な設計と指向性進化実験を組み合わせることで標準的なアルファウイルスレプリカーゼよりも優れたより小さなレプリカーゼが生成されるかもしれません。これをさらに進めると理論的にはRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp)とレプリコンRNA末端の必須の5'および3'非コード領域を組み合わせることで自己増幅に十分です。約2kbの大きさのRdRpsを持つウイルスゲノムは自然界に存在しており[  ]https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(23)00154-3これが将来のレプリコン設計に影響を与える可能性がある。第二に新たに設計されたレプリコンは将来的には現在の遺伝子組み換え生物（GMO）法の対象とならなくなる可能性がある。遺伝子組み換え生物（GMO）に関する日本の法律について以下にまとめます。カルタヘナ法:日本では遺伝子組み換え生物の使用等を規制する主要な法律として「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称：カルタヘナ法）が制定されています。目的と背景:カルタヘナ法は生物多様性条約カルタヘナ議定書を国内で適切に運用するための法律です。遺伝子組み換え生物が生物多様性に与える影響を防止することを目的としています。主な規制内容:事前審査制度遺伝子組み換え生物の使用前に生物多様性への影響を事前に審査します。使用形態による分類: 遺伝子組み換え生物の使用形態を2種類に分けそれぞれに応じたアプローチで規制しています。適切な使用方法の規定: 遺伝子組み換え生物の適切な使用方法について定めています。輸入規制: 海外からの遺伝子組み換え生物の輸入に関する確認義務があります。