クライオ電子顕微鏡法の概要
クライオ電子顕微鏡法 (クライオ電子顕微鏡法) は、タンパク質や核酸などの生体分子を原子レベルに近い解像度で画像化する技術です。クライオ電子顕微鏡法では、サンプルは薄い非晶質氷層で急速に凍結され、ほぼ天然の水和状態が維持されます。次に、凍結したサンプルを電子クライオ顕微鏡で画像化し、その構造を視覚化できます。クライオ電子顕微鏡法が他の構造生物学技術よりも優れている主な利点は、結晶化を必要とせずに高分子複合体を画像化できることと、単一粒子分析アプローチにより異種サンプルからでも構造決定が容易になることです。
クライオ電子顕微鏡法のサンプル準備
クライオ電子顕微鏡法の最初のステップは、サンプル準備です。ここでは、対象の生体分子を精製し、適切な濃度範囲 (通常は 0.1～10 mg/ml) に濃縮します。次に、サンプルは、薄い穴あきポリマー層でコーティングされたサポート グリッドに塗布され、液体窒素で冷却された液体エタンまたはプロパンに浸されて急速に凍結されます。このガラス化プロセスにより、非晶質のガラス状氷が形成され、サンプル分子がほぼ天然の水和状態で固定されます。次に、凍結したサンプル グリッドは電子クライオ顕微鏡にロードされ、ビーム照射によるサンプルの劣化を防ぐために、液体窒素に近い低温でイメージングされます。
クライオ EM を使用したデータ取得
クライオ EM では、ガラス化された生物サンプルは、液体窒素温度で動作する電子クライオ顕微鏡を使用してイメージングされます。電子産業概要ビームがグリッド上の薄い凍結サンプル層を通過し、標本と相互作用します。次に、イメージング検出器が、サンプルに関する構造情報を含む散乱電子を記録します。さまざまなサンプル方向で、数百から数千の顕微鏡画像または「顕微鏡写真」が取得されます。得られる解像度は、検出器のピクセル サイズ、電子ビームの電圧、顕微鏡レンズの球面収差など、さまざまなクライオ EM ハードウェア パラメータによって異なります。最先端のクライオ電子顕微鏡では、3Å を超える解像度を日常的に実現できるようになりました。
クライオ電子顕微鏡の画像処理ワークフロー
クライオ電子顕微鏡で取得した大規模なデータセットは、サンプルの 3D 構造を再構築するために、広範な計算分析が必要です。個々のサンプル粒子は、さまざまな計算ツールを使用して顕微鏡写真から識別および抽出されます。参照なしの 2D 分類が実行され、異質な集団が分離され、品質が評価されます。次に、3D 分類によって初期構造が改良され、粒子が構造的に異なるグループに分類されます。次に、選択された粒子が 3D 自動改良に使用され、粒子の配置と再構築された 3D 密度マップが繰り返し最適化されます。後処理によって、マップの解像度とコントラストがさらに向上します。計算ルーチンは現在、高度に自動化されているため、クライオ電子顕微鏡は専門家以外のユーザーでも利用できます。直接電子検出器、超解像度顕微鏡、クライオ集束イオンビームミリングのブレークスルーにより、クライオ電子顕微鏡の解像度がさらに向上しています。
クライオ電子顕微鏡の応用
過去 10 年間で成熟して以来、クライオ電子顕微鏡は、他の技術では困難であった構造の決定を可能にすることで構造生物学に革命をもたらしました。これにより、リボソーム、ウイルス、膜タンパク質などの大きなタンパク質複合体や集合体の de novo 構造決定が原子レベルに近い解像度で可能になりました。クライオ電子顕微鏡の構造により、転写、翻訳、シグナル伝達などの基本的な細胞プロセスに対する理解が大幅に深まりました。また、SARS-CoV-2 などの病原体に対するメカニズムの洞察も可能になりました。最近の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、サイズが 100kDa 未満の困難な小さなタンパク質複合体の解析に利用できるようになりました。異種および動的システムを分析する能力は、バイオテクノロジーおよび医薬品開発に潜在的に応用できます。ハードウェアとソフトウェアのさらなる改善により、クライオ電子顕微鏡は今後数年間で高解像度構造生物学の主要な技術になると予想されています。
クライオ電子顕微鏡に関する詳細情報(
https://fortunetelleroracle.com/lifestyle/cryo-electron-microscopy-revolutionizing-biological-research-975780 |
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