コロナウイルス
2015年7月23日 - パーブライト研究所
本発明は、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６のうちの１つ以上に変異を含むポリタンパク質をコード変異する型レプリカーゼ遺伝子を含む、生きた弱毒化コロナウイルスを提供する。コロナウイルスは、対象における感染性気管支炎などの疾患を治療および／または予防するためのワクチンとして使用されます。
パーブライト研究所の最新の特許:
弱毒化アフリカ豚コレラウイルスワクチン
異種鳥病原体抗原をコードする組換えガリドヘルペスペウイルス3ワクチン
弱毒化感染性気管支炎ウイルス
組換え融合前RSV Fタンパク質およびその使用
安定化されたFMDVキャプシド
スキップ: 説明 · 主張 · 参照文献 · 特許履歴 · 歴史特許
説明
発明の分野
本発明は、ウイルスの病原性を低下させるコロナ変異型レプリカーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスに関する。 。
発明の背景
伝染性気管支炎 (IB) の病原体である鳥伝染性気管支炎ウイルス (IBV) は、感染力が高い伝染性の高い家禽の病原体であり、主に気道でコピーします、腸や腎臓の上皮細胞でもコピーします。そして卵管。 IBV は、ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス亜科、ガンマコロナウイルス 属のメンバーです。遺伝的に非常によく似たコロナウイルスは、七面鳥、ホロホロ鳥、キジに病気を警戒します。
IBの臨床症状には、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁、喘鳴などがあります。肉類の鳥は体重増加が減少していますが、卵を産む鳥は産む卵の量が少なく、品質の悪い卵を産みます。呼吸器感染症は、ニワトリを二次細菌感染症になりやすいし、ヒナでは危険となる可能性があります。このウイルスは、特に雛の卵管に永久的な損傷を考える可能性がありますがあり、優先の生産量と品質の低下につながります。場合によっては深刻な腎臓病につながることもあります。
IBVは、他のどの感染症よりも養鶏産業に大きな経済的損失をもたらしていると報告されています。弱毒化生ワクチンと不活化ワクチンはIBVの制御に広く使用されていますが、ワクチンの使用によって得られる防御は、ワクチンの故障または使用されたワクチンに関係のない新しいIBV血清型の導入により失われる可能性があり、養鶏業界へのリスク。
さらに、産業界では、ワクチン接種プログラムの効率と費用対効果を改善するために、卵内での使用に適したワクチンを開発する必要がある。現在のIBVワクチンは発育卵中で複数回継代した後に得られるため、ニワトリただし、このようなウイルスはほとんどの場合、胚に対して毒性の増加を示すため、培養率の低下を念頭に置くため、場合によっては、培養率が70％低下することもあります。
これは経験的な方法であり、ウイルスの弱毒化は偶然であり、ウイルスが継代されるたびに異なるため、弱毒化を目的として同じウイルスを異なる連続の卵に継代すると、弱毒化につながる異なる連続の突然変異が関連して扱われます。このプロセスに有効にする性質もあります。 S遺伝子にも変異が発生する可能性があり、免疫原への影響を考慮する可能性があるため、備えて免疫応答が影響を受け、潜在的なワクチンが必要な血清型を防御できない可能性がある。 さらに、ワクチンの毒性への復帰と安定する関連の問題もある。
IBVを制御するには、新しくて安全なワクチンが開発されることが重要です。
本発明の態様の概要
本発明者らは、ＩＢＶを合理的に弱めるために逆遺伝学アプローチを使用した。そのため、発育卵で複数回継代した後のランダムな弱毒化よりもはるかに制御可能です。
本発明者らは、逆遺伝学的なアプローチを用いて、ウイルスの病原性レベルの低下を考慮して様々な種類を同定した。て病原性を持たずにコピーできるように低下させることができる。 このようなウイルスは、卵内ワクチン接種に適している可能性があり、これは大きな猶予であり、卵の中で複数回発育する回継代した後に製造される弱毒化IBVワクチンよりも改善されている。
そこで、第１の態様では、本発明は、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５のうちの１つ以上に変異を含むポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含み、弱毒化された生きたコロナウイルスを提供する。またはnsp-16。
変異体レプリカーゼ遺伝子は、以下のリストから選択される1つまたは複数のアミノ酸変異を含むタンパク質をコードし得る：
配列番号６の８５位のプロからLeu、
配列番号７の３９３位のＶａｌからＬｅｕ；
配列番号８の１８３位のレウからイル；
配列番号９の２０９位のＶａｌからＩｌｅ。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位にＰｒからＬｅｕへのアミノ酸変異を含むタンパク質をコードし得る。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位にアミノ酸変異ＶａｌからＬｅｕを含むタンパク質をコードし得る。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位にアミノ酸変異ＰｒｏからＬｅｕを含むタンパク質をコードし得る。 配列番号７の３９３位のＶａｌからＬｅｕ；配列番号８の１８３位のＬｅｕからＩｌｅ；および配列番号９の２０９位のヴァルからイレ。
レプリカーゼ遺伝子は、以下のリストから選択される1つまたは複数のヌクレオチド交換を含み得る：
ヌクレオチド位置 12137 で C から T。
ヌクレオチド位置 18114 で G から C。
ヌクレオチド位置 19047 で T から A。
ヌクレオチド位置 20139 で G から A;
配列番号１として表示される配列と比較される。
コロナウイルスは感染性気管支炎（IBV）である可能性があります。
コロナウイルスはIBV M41である可能性があります。
コロナウイルスは、最も一部がM41以外のIBV血清型に由来するSタンパク質を含む可能性がある。
例えば、S1サブユニットまたはSタンパク質全体は、M41以外のIBV血清型に由来する可能性がある。
本発明の第１の態様によるコロナウイルスは、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して病原性が低下しており、そのため、ウイルスが発育卵に投与された場合、胚に対して病原性を持たずにコピーすることができる。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関連して定義された変異体レプリカーゼ遺伝子を提供する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による変異体コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるレプリカーゼ遺伝子を含むプラスミドを提供する。
第５の態様では、本発明は、以下の工程を含む、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを作成する方法を提供する。
（i）本発明の第４の態様によるプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする工程；
（ii）レプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含む組換えウイルスで宿主細胞を感染させる工程；
(iii) プラスミド内のレプリカーゼ遺伝子配列と組換えウイルスゲノム内で対応する配列との間で同じ組換えを起こして、改変されたレプリカーゼ遺伝子を生成するステップ；そして
(iv) 変更されたレプリカーゼ遺伝子を含む組換えウイルスを選択するステップ。
組換えウイルスはワクシニアウイルスであってもよい。
この方法には、次のステップも含まれる場合があります。
（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの組換えウイルスのＤＮＡから修飾レプリカーゼ遺伝子を含む組換えコロナウイルスを回収する。
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを生成することができる細胞を提供する。
第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナと薬学的に許容される担体とを含むワクチンを提供するウイルス。
第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様によるワクチンを対象に投与するステップを含む、対象における疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
本発明の態度は、以下を提供する。
対象における疾患の治療および／または予防に使用するための本発明の第７の態様によるワクチン。
対象における疾患を治療および／または予防するためのワクチンの製造における、本発明の第１の態様によるコロナウイルスの使用。
この疾患は感染性気管支炎（IB）である可能性があります。
ワクチンの投与方法は、以下からなる群から選択されます。 点眼投与、鼻腔内投与、飲料水投与、培養後注射および卵内注射。
ワクチン接種は承認内ワクチン接種による場合があります。
本発明はまた、本発明の第６の態様による細胞を本発明の第１の態様によるコロナウイルスに感染させる工程を含む、本発明の第７の態様によるワクチンを製造する方法を提供する。
図面の説明
イチジク。 1 —CK 細胞における M41-CK (M41 EP4) と比較した M41-R-6 および M41-R-12 の増殖動態
イチジク。 2 —M41-CK (M41 EP4) および Beau-R と比較した M41-R-6 および M41-R-12 に関連する臨床症状候、鼻息および喘鳴 (バーは模擬、Beau-R、M41-R 6、M41 -) 各時点の左から右に R 12、M41-CK EP4）。
イチジク。 3 -感染した雛から採取した気管から単離した気管輪におけるウイルスの繊毛活動。 100%の繊毛活動はウイルスによる影響がないことを示します。無病原性、活性0%は、繊毛活動の完全な喪失、完全な繊毛静止を示し、ウイルスが病原性であることを示します (バーは、各時点の左から右にモック、Beau-R、M41-R 6、M41-R 12、M41-CK EP4)を示します）。
イチジク。 4 —M41-R-12 および M41-CK (M41 EP5) と比較した、M41R-nsp10rep および M41R-nsp14、15、16rep に関連する臨床症状候、スニッキング (バーはモック、M41-R12、M41R-nsp10rep、M41R) -nsp14 を示す)各時点の左から右に、15、16rep、および M41-CK EP5)。
イチジク。 5 —感染した鶏から採取した気管から単離した気管リングにおける M41R-nsp10rep および M41R-nsp14,15,16rep の毛様体活性を M41-R-12 および M41-CK と比較したもの（バーはモックを示す。 M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R それぞれの時点の左から右に -nsp14、15、16rep および M41-CK EP5)。
イチジク。 6 —M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K と M41-CK と比較した M41-K に関連する臨床症状候、スニッキング (バーは模擬を示す)各時点の左から右に、M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10、14、15rep10; M41-K6 および M41-CK EP4）。
イチジク。 7 —M41-CK と比較した M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K に関連する臨床症状候、喘鳴（バー）は模擬を示す）各時点の左から右に、M41R-nsp10,15rep1; M14R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10、14、15rep10; M41-K6 および M41-CK EP4）。
イチジク。 8 —気管から採取した気管リングにおける M41-CK と比較した、M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K の感染したヒナ (バーは、左から右にモック、M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 およびM41-CK EP4 を示す)各時点)。
イチジク。 9 - CK 細胞上での M41-CK と比較した rIBV の増殖動態。 イチジク。 9A M41-RとM41-Kの結果を示します。 イチジク。 9B M41-nsp10 担当者の結果を示します。 M41R-nsp14、15、16 担当者。 M41R-nsp10、15 担当者。 M41R-nsp10、15、16 担当者。 M41R-nsp10、14、15 担当者。 M41R-nsp10、14、16。
イチジク。 10 - 変異した nsp10、nsp14、nsp15、および nsp16 配列内のアミノ酸変異の位置。
イチジク。 11 —A) 笑いながら。 B) 呼吸器症状 (喘鳴と騒音の組み合わせ)、および C) M41-CK と比較した rIBV M41R-nsp 10,14 rep および rIBV M41R-nsp 10,16 rep の毛様体アクティブ (バーはモック、M41R-nsp10,14rep、M41R を示す) 各時点の左から右に -nsp10,16rep および M41-K)。
詳細な説明
本発明は、コロナウイルス中で発現すると、野生型レプリカーゼ遺伝子を含む対応するコロナウイルスと比較してウイルスの病原性が低下する変異型レプリカーゼ遺伝子を含むコロナウイルスを提供する。
コロナウイルス
ガンマコロナウイルス は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの属です。コロナウイルスは、プラス方向の一本鎖 RNA ゲノムと螺旋対称性を持つエンベロープ ウイルスです。
コロナウイルスのゲノムサイズは約27～32キロベースの範囲にあり、これは既知のRNAウイルスの中で最も長いサイズです。
コロナウイルスは主に乳類や鳥類の上気道または胃腸管感染します。現在知られているコロナウイルスの5～6種類の株が人に感染します。重症急性呼吸器症候群（SARS）を考えると、SARS-CoVは、上気道感染症と下気道感染症の両方を考えて、胃腸炎が考えられる可能性があるため、独特の病因を持っています。症候群コロナウイルス（MERS-CoV）も、ヒト下気道感染症を冷静に考えます。コロナウイルスは、成人におけるすべての風邪のかなりの割合を考えて考えられています。
コロナウイルスはまた、家畜や飼いならされたペットにさまざまな病気を考慮し、その中には重篤なものもあり、農業産業を見据えていると思います。経済的に重要な家畜のコロナウイルスには、主に鶏に呼吸器疾患を考慮し、世界中の家禽産業に深刻な影響を考慮する伝染性気管支炎ウイルス（IBV）が含まれます。ブタコロナウイルス（伝染性胃腸炎、TGE）とウシコロナウイルス、どちらも猫コロナウイルスには2つの型があり、猫腸ウイルスは臨床的に非常に重要ではない病原体ですが、このウイルスの自然変異は、高い死亡率を伴う疾患ですである猫伝染性腹膜炎 (FIP) を考える可能性があります。
犬コロナウイルス（CCoV）にも 2 つのタイプがあり、1 つは軽度の胃腸疾患を考えるもの、もう 1 つは呼吸器疾患を考えることが重要です。マウス肝炎ウイルス (MHV) は、特に実験用マウスのコロニーの間で、死亡率の高い流行性マウス疾患を一応コロナウイルスです。
コロナウイルスは以下に示すように 4 つのグループに分類されます。
アルファ
犬コロナウイルス（CCoV）
猫コロナウイルス（FeCoV）
ヒトコロナウイルス 229E (HCoV-229E)
豚流行性ウイルス下痢（PEDV）
伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）
ヒトコロナウイルス NL63 (NL またはニューヘブン)
ベータ
ウシコロナウイルス（BCoV）
イヌ呼吸器コロナウイルス（CRCoV）—東南アジアとミクロネシアで一般的
ヒトコロナウイルス OC43 (HCoV-OC43)
マウス肝炎ウイルス (MHV)
豚赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（HEV）
ラットコロナウイルス（ロイ）。 ラットウイルスコロナはオーストラリア東部で非常に蔓延しており、2008年3月から4月の時点で来および野生のげっ歯類のコロニーで発見されています。
(早速では一般名はありません) (HCoV-HKU1)
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）
ガンマ
伝染性気管支炎ウイルス（IBV）
トルココロナウイルス（ブルーコムウイルス）
キジコロナウイルス
ホロホロ鳥コロナウイルス
デルタ
ヒヨドリコロナウイルス（BuCoV）
ツグミコロナウイルス（ThCoV）
ムンニアコロナウイルス（MuCoV）
ブタコロナウイルス (PorCov) HKU15
本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、TGEVなどのアルファコロナウイルスに由来し得る。 MHVなどのベータコロナウイルス。またはガンマコロナウイルスIBV など。
本明細書で使用される場合、用語「由来」は、レプリカーゼ遺伝子が、関連するコロナウイルスの野生型レプリカーゼ遺伝子と実質的に同じヌクレオチド配列を含むことを意味する。遺伝子は、野生型レプリカーゼ配列と最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有して得られる。変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子は、非構造タンパク質（nsp）-10 、nsp-14、nsp-15、またはnsp-16の1つまたは複数に変異を含むタンパク質をコードします（非構造タンパク質の野生型配列と比較した場合）。
IBV
鳥伝染性気管支炎（IB）は、鶏の急性かつ伝染性の高い呼吸器疾患であり、深刻な経済的警戒を警戒します。この病気は、あえぎ、咳、くしゃみ、気管音、鼻汁などの若い鶏では、体重の呼吸困難が発生することがあります。産卵期では、呼吸困難、腎炎、産卵量の減少、卵内部の品質や卵殻の品質の低下がよく見られますあります。
ブロイラーでは、咳やガラガラ音は一般的な臨床症状であり、敷地内のすべての鳥に急速に広がります。 、二次感染によって異なりますが、ワクチン接種を受けていない場合では最大60%になる可能性があります。
最初に特定されたIBV血清型はマサチューセッツ型でしたが、米国では現在、最初に特定されたマサチューセッツ型に加えて、アーカンソー型やデラウェア型を含むいくつかの血清型が流行しています。
IBV 株 Beaudette は、ニワトリ胚で最低 150 継代を経て得られました。
H120は市販の弱毒生IBVマサチューセッツ血清型ワクチン株であり、発育鶏卵で約120継代により弱毒化されています。 H52は別のマサチューセッツ州ワクチンで、H120の開発中、初期のわずかに病原性の高い継代ウイルス（継代52）に相当します。H120に基づくワクチンが一般的に使用されます。
IB QXは、IBVの毒性の高いフィールド分離株です。このウイルスは、1990年代半ばに中国の青島地域で病気が発生した後に分離されたため、「チャイニーズQX」としても知られています。ウイルスはヨーロッパに忍び寄ってきました。 2004年以降、西ヨーロッパの一部地域、主にオランダで、非常によく似たウイルスによる深刻な卵生産の問題が確認されていますが、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマーク、英国からも報告されています。
オランダの事件から分離されたウイルスは、デーヴェンターのオランダ研究所によってD388と呼ばれる新株として特定された。検査から得られました。現在、弱毒生QX様IBVワクチン株が開発されています。
IBV は細胞質内でコピーするエンベロープウイルスで、非分節の一本鎖プラスセンス RNA ゲノムを含んでいます。 IBV は 27.6 kb の RNA ゲノムを持ち、すべてのコロナウイルスと同様に 4 つの構造タンパク質を含んでいますスパイク糖タンパク質 (S)、小膜タンパク質 (E)、内在性膜タンパク質 (M)、およびゲノム RNA と相互作用するヌクレオカプシドタンパク質 (N) です。
ゲノムは次のように構成されています: 5'UTR - ポリメラーゼ (レプリカーゼ) 遺伝子 - 構造タンパク質遺伝子 (S-E-M-N) - UTR 3'。ここで、UTR は非翻訳領域(IBVではそれぞれ約500ヌクレオチド)である。
脂質エンベロープには、S、M、Eの3つの膜タンパク質が含まれています。IBV Sタンパク質は、小細胞体でオリゴマー化してホモ三量体に組み立てられ、膜接合ドメインを介してビリオン膜に挿入されますされ、非共有結合によって結合する I 型糖タンパク質です。 M タンパク質との相互作用。 S 糖タンパク質は 4 つのドメインで構成されています。合成中に切断される反対配列です。外部ドメインはビリオン粒子の外側に存在します。 S タンパク質をビリオン粒子の脂質の二重層に固定する役割をそして細胞質尾部。
すべてのコロナウイルスはまた、イントロでのコピーには必要ではないが、病因に役割を果たしている可能性がある未知の機能を持つ連続のアクセサリー遺伝子をコードしています。 、遺伝子 3 および 5 をコードしており、両方とも 2 つのアクセサリータンパク質 3a、3b および 5a、5b をそれぞれ表現します。
本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、ＩＢＶに由来し得ます。例えば、ＩＢＶは、ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｈ１２０、Ｈ５２、ＩＢ ＱＸ、Ｄ３８８、またはＭ４１であり得ます。
ＩＢＶはＩＢＶ Ｍ４１であってもよい。 M41は、1941年米国で分離されたマサチューッツ血清型の原型です。株であり、ATCC (VR-21™) から入手できます。弱毒化変異体は、マサチューセッツ血清型に対するIBVワクチンとしてもいくつかのワクチン製造業者によって使用されており、現場で問題を考えています。本発明者らは、このウイルスについて長年研究しており、完全ナウイルスゲノムの配列が入手可能であるため、この株を使用することを選択した。 ＣＫは、初代ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞で増殖するように適応されており、完全ゲノムのｃＤＮＡから感染性ウイルスとして回収できると考えられた。これは病原性ＩＢＶの代表的なものであるため、病原性の喪失または低下をのために分析できます。
IBV M41-CKのゲノム配列は配列番号1として提供される。
2015年7月23日 - パーブライト研究所
本発明は、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５またはｎｓｐ−１６のうちの１つ以上に変異を含むポリタンパク質をコード変異する型レプリカーゼ遺伝子を含む、生きた弱毒化コロナウイルスを提供する。コロナウイルスは、対象における感染性気管支炎などの疾患を治療および／または予防するためのワクチンとして使用されます。
パーブライト研究所の最新の特許:
弱毒化アフリカ豚コレラウイルスワクチン
異種鳥病原体抗原をコードする組換えガリドヘルペスペウイルス3ワクチン
弱毒化感染性気管支炎ウイルス
組換え融合前RSV Fタンパク質およびその使用
安定化されたFMDVキャプシド
スキップ: 説明 · 主張 · 参照文献 · 特許履歴 · 歴史特許
説明
発明の分野
本発明は、ウイルスの病原性を低下させるコロナ変異型レプリカーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスに関する。 。
発明の背景
伝染性気管支炎 (IB) の病原体である鳥伝染性気管支炎ウイルス (IBV) は、感染力が高い伝染性の高い家禽の病原体であり、主に気道でコピーします、腸や腎臓の上皮細胞でもコピーします。そして卵管。 IBV は、ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス亜科、ガンマコロナウイルス 属のメンバーです。遺伝的に非常によく似たコロナウイルスは、七面鳥、ホロホロ鳥、キジに病気を警戒します。
IBの臨床症状には、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁、喘鳴などがあります。肉類の鳥は体重増加が減少していますが、卵を産む鳥は産む卵の量が少なく、品質の悪い卵を産みます。呼吸器感染症は、ニワトリを二次細菌感染症になりやすいし、ヒナでは危険となる可能性があります。このウイルスは、特に雛の卵管に永久的な損傷を考える可能性がありますがあり、優先の生産量と品質の低下につながります。場合によっては深刻な腎臓病につながることもあります。
IBVは、他のどの感染症よりも養鶏産業に大きな経済的損失をもたらしていると報告されています。弱毒化生ワクチンと不活化ワクチンはIBVの制御に広く使用されていますが、ワクチンの使用によって得られる防御は、ワクチンの故障または使用されたワクチンに関係のない新しいIBV血清型の導入により失われる可能性があり、養鶏業界へのリスク。
さらに、産業界では、ワクチン接種プログラムの効率と費用対効果を改善するために、卵内での使用に適したワクチンを開発する必要がある。現在のIBVワクチンは発育卵中で複数回継代した後に得られるため、ニワトリただし、このようなウイルスはほとんどの場合、胚に対して毒性の増加を示すため、培養率の低下を念頭に置くため、場合によっては、培養率が70％低下することもあります。
これは経験的な方法であり、ウイルスの弱毒化は偶然であり、ウイルスが継代されるたびに異なるため、弱毒化を目的として同じウイルスを異なる連続の卵に継代すると、弱毒化につながる異なる連続の突然変異が関連して扱われます。このプロセスに有効にする性質もあります。 S遺伝子にも変異が発生する可能性があり、免疫原への影響を考慮する可能性があるため、備えて免疫応答が影響を受け、潜在的なワクチンが必要な血清型を防御できない可能性がある。 さらに、ワクチンの毒性への復帰と安定する関連の問題もある。
IBVを制御するには、新しくて安全なワクチンが開発されることが重要です。
本発明の態様の概要
本発明者らは、ＩＢＶを合理的に弱めるために逆遺伝学アプローチを使用した。そのため、発育卵で複数回継代した後のランダムな弱毒化よりもはるかに制御可能です。
本発明者らは、逆遺伝学的なアプローチを用いて、ウイルスの病原性レベルの低下を考慮して様々な種類を同定した。て病原性を持たずにコピーできるように低下させることができる。 このようなウイルスは、卵内ワクチン接種に適している可能性があり、これは大きな猶予であり、卵の中で複数回発育する回継代した後に製造される弱毒化IBVワクチンよりも改善されている。
そこで、第１の態様では、本発明は、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１０、ｎｓｐ−１４、ｎｓｐ−１５のうちの１つ以上に変異を含むポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含み、弱毒化された生きたコロナウイルスを提供する。またはnsp-16。
変異体レプリカーゼ遺伝子は、以下のリストから選択される1つまたは複数のアミノ酸変異を含むタンパク質をコードし得る：
配列番号６の８５位のプロからLeu、
配列番号７の３９３位のＶａｌからＬｅｕ；
配列番号８の１８３位のレウからイル；
配列番号９の２０９位のＶａｌからＩｌｅ。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位にＰｒからＬｅｕへのアミノ酸変異を含むタンパク質をコードし得る。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号７の３９３位にアミノ酸変異ＶａｌからＬｅｕを含むタンパク質をコードし得る。
レプリカーゼ遺伝子は、配列番号６の８５位にアミノ酸変異ＰｒｏからＬｅｕを含むタンパク質をコードし得る。 配列番号７の３９３位のＶａｌからＬｅｕ；配列番号８の１８３位のＬｅｕからＩｌｅ；および配列番号９の２０９位のヴァルからイレ。
レプリカーゼ遺伝子は、以下のリストから選択される1つまたは複数のヌクレオチド交換を含み得る：
ヌクレオチド位置 12137 で C から T。
ヌクレオチド位置 18114 で G から C。
ヌクレオチド位置 19047 で T から A。
ヌクレオチド位置 20139 で G から A;
配列番号１として表示される配列と比較される。
コロナウイルスは感染性気管支炎（IBV）である可能性があります。
コロナウイルスはIBV M41である可能性があります。
コロナウイルスは、最も一部がM41以外のIBV血清型に由来するSタンパク質を含む可能性がある。
例えば、S1サブユニットまたはSタンパク質全体は、M41以外のIBV血清型に由来する可能性がある。
本発明の第１の態様によるコロナウイルスは、対応する野生型レプリカーゼを発現するコロナウイルスと比較して病原性が低下しており、そのため、ウイルスが発育卵に投与された場合、胚に対して病原性を持たずにコピーすることができる。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に関連して定義された変異体レプリカーゼ遺伝子を提供する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による変異体コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるレプリカーゼ遺伝子を含むプラスミドを提供する。
第５の態様では、本発明は、以下の工程を含む、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを作成する方法を提供する。
（i）本発明の第４の態様によるプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする工程；
（ii）レプリカーゼ遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含む組換えウイルスで宿主細胞を感染させる工程；
(iii) プラスミド内のレプリカーゼ遺伝子配列と組換えウイルスゲノム内で対応する配列との間で同じ組換えを起こして、改変されたレプリカーゼ遺伝子を生成するステップ；そして
(iv) 変更されたレプリカーゼ遺伝子を含む組換えウイルスを選択するステップ。
組換えウイルスはワクシニアウイルスであってもよい。
この方法には、次のステップも含まれる場合があります。
（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの組換えウイルスのＤＮＡから修飾レプリカーゼ遺伝子を含む組換えコロナウイルスを回収する。
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナウイルスを生成することができる細胞を提供する。
第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコロナと薬学的に許容される担体とを含むワクチンを提供するウイルス。
第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様によるワクチンを対象に投与するステップを含む、対象における疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
本発明の態度は、以下を提供する。
対象における疾患の治療および／または予防に使用するための本発明の第７の態様によるワクチン。
対象における疾患を治療および／または予防するためのワクチンの製造における、本発明の第１の態様によるコロナウイルスの使用。
この疾患は感染性気管支炎（IB）である可能性があります。
ワクチンの投与方法は、以下からなる群から選択されます。 点眼投与、鼻腔内投与、飲料水投与、培養後注射および卵内注射。
ワクチン接種は承認内ワクチン接種による場合があります。
本発明はまた、本発明の第６の態様による細胞を本発明の第１の態様によるコロナウイルスに感染させる工程を含む、本発明の第７の態様によるワクチンを製造する方法を提供する。
図面の説明
イチジク。 1 —CK 細胞における M41-CK (M41 EP4) と比較した M41-R-6 および M41-R-12 の増殖動態
イチジク。 2 —M41-CK (M41 EP4) および Beau-R と比較した M41-R-6 および M41-R-12 に関連する臨床症状候、鼻息および喘鳴 (バーは模擬、Beau-R、M41-R 6、M41 -) 各時点の左から右に R 12、M41-CK EP4）。
イチジク。 3 -感染した雛から採取した気管から単離した気管輪におけるウイルスの繊毛活動。 100%の繊毛活動はウイルスによる影響がないことを示します。無病原性、活性0%は、繊毛活動の完全な喪失、完全な繊毛静止を示し、ウイルスが病原性であることを示します (バーは、各時点の左から右にモック、Beau-R、M41-R 6、M41-R 12、M41-CK EP4)を示します）。
イチジク。 4 —M41-R-12 および M41-CK (M41 EP5) と比較した、M41R-nsp10rep および M41R-nsp14、15、16rep に関連する臨床症状候、スニッキング (バーはモック、M41-R12、M41R-nsp10rep、M41R) -nsp14 を示す)各時点の左から右に、15、16rep、および M41-CK EP5)。
イチジク。 5 —感染した鶏から採取した気管から単離した気管リングにおける M41R-nsp10rep および M41R-nsp14,15,16rep の毛様体活性を M41-R-12 および M41-CK と比較したもの（バーはモックを示す。 M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R それぞれの時点の左から右に -nsp14、15、16rep および M41-CK EP5)。
イチジク。 6 —M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K と M41-CK と比較した M41-K に関連する臨床症状候、スニッキング (バーは模擬を示す)各時点の左から右に、M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10、14、15rep10; M41-K6 および M41-CK EP4）。
イチジク。 7 —M41-CK と比較した M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K に関連する臨床症状候、喘鳴（バー）は模擬を示す）各時点の左から右に、M41R-nsp10,15rep1; M14R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10、14、15rep10; M41-K6 および M41-CK EP4）。
イチジク。 8 —気管から採取した気管リングにおける M41-CK と比較した、M41R-nsp10、15rep、M41R-nsp10、14、15rep、M41R-nsp10、14、16rep、M41R-nsp10、15、16rep、および M41-K の感染したヒナ (バーは、左から右にモック、M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 およびM41-CK EP4 を示す)各時点)。
イチジク。 9 - CK 細胞上での M41-CK と比較した rIBV の増殖動態。 イチジク。 9A M41-RとM41-Kの結果を示します。 イチジク。 9B M41-nsp10 担当者の結果を示します。 M41R-nsp14、15、16 担当者。 M41R-nsp10、15 担当者。 M41R-nsp10、15、16 担当者。 M41R-nsp10、14、15 担当者。 M41R-nsp10、14、16。
イチジク。 10 - 変異した nsp10、nsp14、nsp15、および nsp16 配列内のアミノ酸変異の位置。
イチジク。 11 —A) 笑いながら。 B) 呼吸器症状 (喘鳴と騒音の組み合わせ)、および C) M41-CK と比較した rIBV M41R-nsp 10,14 rep および rIBV M41R-nsp 10,16 rep の毛様体アクティブ (バーはモック、M41R-nsp10,14rep、M41R を示す) 各時点の左から右に -nsp10,16rep および M41-K)。
詳細な説明
本発明は、コロナウイルス中で発現すると、野生型レプリカーゼ遺伝子を含む対応するコロナウイルスと比較してウイルスの病原性が低下する変異型レプリカーゼ遺伝子を含むコロナウイルスを提供する。
コロナウイルス
ガンマコロナウイルス は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの属です。コロナウイルスは、プラス方向の一本鎖 RNA ゲノムと螺旋対称性を持つエンベロープ ウイルスです。
コロナウイルスのゲノムサイズは約27～32キロベースの範囲にあり、これは既知のRNAウイルスの中で最も長いサイズです。
コロナウイルスは主に乳類や鳥類の上気道または胃腸管感染します。現在知られているコロナウイルスの5～6種類の株が人に感染します。重症急性呼吸器症候群（SARS）を考えると、SARS-CoVは、上気道感染症と下気道感染症の両方を考えて、胃腸炎が考えられる可能性があるため、独特の病因を持っています。症候群コロナウイルス（MERS-CoV）も、ヒト下気道感染症を冷静に考えます。コロナウイルスは、成人におけるすべての風邪のかなりの割合を考えて考えられています。
コロナウイルスはまた、家畜や飼いならされたペットにさまざまな病気を考慮し、その中には重篤なものもあり、農業産業を見据えていると思います。経済的に重要な家畜のコロナウイルスには、主に鶏に呼吸器疾患を考慮し、世界中の家禽産業に深刻な影響を考慮する伝染性気管支炎ウイルス（IBV）が含まれます。ブタコロナウイルス（伝染性胃腸炎、TGE）とウシコロナウイルス、どちらも猫コロナウイルスには2つの型があり、猫腸ウイルスは臨床的に非常に重要ではない病原体ですが、このウイルスの自然変異は、高い死亡率を伴う疾患ですである猫伝染性腹膜炎 (FIP) を考える可能性があります。
犬コロナウイルス（CCoV）にも 2 つのタイプがあり、1 つは軽度の胃腸疾患を考えるもの、もう 1 つは呼吸器疾患を考えることが重要です。マウス肝炎ウイルス (MHV) は、特に実験用マウスのコロニーの間で、死亡率の高い流行性マウス疾患を一応コロナウイルスです。
コロナウイルスは以下に示すように 4 つのグループに分類されます。
アルファ
犬コロナウイルス（CCoV）
猫コロナウイルス（FeCoV）
ヒトコロナウイルス 229E (HCoV-229E)
豚流行性ウイルス下痢（PEDV）
伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）
ヒトコロナウイルス NL63 (NL またはニューヘブン)
ベータ
ウシコロナウイルス（BCoV）
イヌ呼吸器コロナウイルス（CRCoV）—東南アジアとミクロネシアで一般的
ヒトコロナウイルス OC43 (HCoV-OC43)
マウス肝炎ウイルス (MHV)
豚赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（HEV）
ラットコロナウイルス（ロイ）。 ラットウイルスコロナはオーストラリア東部で非常に蔓延しており、2008年3月から4月の時点で来および野生のげっ歯類のコロニーで発見されています。
(早速では一般名はありません) (HCoV-HKU1)
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）
ガンマ
伝染性気管支炎ウイルス（IBV）
トルココロナウイルス（ブルーコムウイルス）
キジコロナウイルス
ホロホロ鳥コロナウイルス
デルタ
ヒヨドリコロナウイルス（BuCoV）
ツグミコロナウイルス（ThCoV）
ムンニアコロナウイルス（MuCoV）
ブタコロナウイルス (PorCov) HKU15
本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、TGEVなどのアルファコロナウイルスに由来し得る。 MHVなどのベータコロナウイルス。またはガンマコロナウイルスIBV など。
本明細書で使用される場合、用語「由来」は、レプリカーゼ遺伝子が、関連するコロナウイルスの野生型レプリカーゼ遺伝子と実質的に同じヌクレオチド配列を含むことを意味する。遺伝子は、野生型レプリカーゼ配列と最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有して得られる。変異型コロナウイルスレプリカーゼ遺伝子は、非構造タンパク質（nsp）-10 、nsp-14、nsp-15、またはnsp-16の1つまたは複数に変異を含むタンパク質をコードします（非構造タンパク質の野生型配列と比較した場合）。
IBV
鳥伝染性気管支炎（IB）は、鶏の急性かつ伝染性の高い呼吸器疾患であり、深刻な経済的警戒を警戒します。この病気は、あえぎ、咳、くしゃみ、気管音、鼻汁などの若い鶏では、体重の呼吸困難が発生することがあります。産卵期では、呼吸困難、腎炎、産卵量の減少、卵内部の品質や卵殻の品質の低下がよく見られますあります。
ブロイラーでは、咳やガラガラ音は一般的な臨床症状であり、敷地内のすべての鳥に急速に広がります。 、二次感染によって異なりますが、ワクチン接種を受けていない場合では最大60%になる可能性があります。
最初に特定されたIBV血清型はマサチューセッツ型でしたが、米国では現在、最初に特定されたマサチューセッツ型に加えて、アーカンソー型やデラウェア型を含むいくつかの血清型が流行しています。
IBV 株 Beaudette は、ニワトリ胚で最低 150 継代を経て得られました。
H120は市販の弱毒生IBVマサチューセッツ血清型ワクチン株であり、発育鶏卵で約120継代により弱毒化されています。 H52は別のマサチューセッツ州ワクチンで、H120の開発中、初期のわずかに病原性の高い継代ウイルス（継代52）に相当します。H120に基づくワクチンが一般的に使用されます。
IB QXは、IBVの毒性の高いフィールド分離株です。このウイルスは、1990年代半ばに中国の青島地域で病気が発生した後に分離されたため、「チャイニーズQX」としても知られています。ウイルスはヨーロッパに忍び寄ってきました。 2004年以降、西ヨーロッパの一部地域、主にオランダで、非常によく似たウイルスによる深刻な卵生産の問題が確認されていますが、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマーク、英国からも報告されています。
オランダの事件から分離されたウイルスは、デーヴェンターのオランダ研究所によってD388と呼ばれる新株として特定された。検査から得られました。現在、弱毒生QX様IBVワクチン株が開発されています。
IBV は細胞質内でコピーするエンベロープウイルスで、非分節の一本鎖プラスセンス RNA ゲノムを含んでいます。 IBV は 27.6 kb の RNA ゲノムを持ち、すべてのコロナウイルスと同様に 4 つの構造タンパク質を含んでいますスパイク糖タンパク質 (S)、小膜タンパク質 (E)、内在性膜タンパク質 (M)、およびゲノム RNA と相互作用するヌクレオカプシドタンパク質 (N) です。
ゲノムは次のように構成されています: 5'UTR - ポリメラーゼ (レプリカーゼ) 遺伝子 - 構造タンパク質遺伝子 (S-E-M-N) - UTR 3'。ここで、UTR は非翻訳領域(IBVではそれぞれ約500ヌクレオチド)である。
脂質エンベロープには、S、M、Eの3つの膜タンパク質が含まれています。IBV Sタンパク質は、小細胞体でオリゴマー化してホモ三量体に組み立てられ、膜接合ドメインを介してビリオン膜に挿入されますされ、非共有結合によって結合する I 型糖タンパク質です。 M タンパク質との相互作用。 S 糖タンパク質は 4 つのドメインで構成されています。合成中に切断される反対配列です。外部ドメインはビリオン粒子の外側に存在します。 S タンパク質をビリオン粒子の脂質の二重層に固定する役割をそして細胞質尾部。
すべてのコロナウイルスはまた、イントロでのコピーには必要ではないが、病因に役割を果たしている可能性がある未知の機能を持つ連続のアクセサリー遺伝子をコードしています。 、遺伝子 3 および 5 をコードしており、両方とも 2 つのアクセサリータンパク質 3a、3b および 5a、5b をそれぞれ表現します。
本発明のコロナウイルスの変異型レプリカーゼ遺伝子は、ＩＢＶに由来し得ます。例えば、ＩＢＶは、ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｈ１２０、Ｈ５２、ＩＢ ＱＸ、Ｄ３８８、またはＭ４１であり得ます。
ＩＢＶはＩＢＶ Ｍ４１であってもよい。 M41は、1941年米国で分離されたマサチューッツ血清型の原型です。株であり、ATCC (VR-21™) から入手できます。弱毒化変異体は、マサチューセッツ血清型に対するIBVワクチンとしてもいくつかのワクチン製造業者によって使用されており、現場で問題を考えています。本発明者らは、このウイルスについて長年研究しており、完全ナウイルスゲノムの配列が入手可能であるため、この株を使用することを選択した。 ＣＫは、初代ニワトリ腎臓（ＣＫ）細胞で増殖するように適応されており、完全ゲノムのｃＤＮＡから感染性ウイルスとして回収できると考えられた。これは病原性ＩＢＶの代表的なものであるため、病原性の喪失または低下をのために分析できます。
IBV M41-CKのゲノム配列は配列番号1として提供される。
