ブログネタ：
好きな食べ物は？
参加中
本文はここから
棗 龍一郎 空想幻想曲 面白画像妄想創作お笑いへ
http://ameblo.jp/lucky- smile-blog/
←面白画像満載 入口
棗 龍一郎 空想幻想曲 面白画像妄想創作お笑いへ
http://ameblo.jp/lucky- smile-blog/
なつめ りゅういちろう ナツメリュウイチロウ 面白写真 爆笑 なんて読む
なん とよむ ブログ アメーバ ameba google yahoo msn goo ランキング
妄想 日記 なつめ 棗龍一郎（なつめ） 棗龍一郎（ナ ツメ） natumeryuitirou
棗（ natume） natsume ryuuitirou ブログネタ お もしろい おわらい
ジブ リ 裏ジブリ ムスカ大佐 スキー場 スノーボー ド 雪 snow winter 冬
omosirogazou omosirosyashin ski snowborad owarai warai ranking
グー グル ヤフー マイクロソフト グー シノビ ニ ンジャツールズ シーサー
ぐー ぐる ごおｇる やほお ごお しのび にんじゃ つーるず しーさー
忍者 ツールズ 忍び seaserblog livedoor ライブド ア fc2 エフシーツー
うぃ き ウィキペディア 人気ランキング seo アク セスアップ トラフィックエクスチェンジ
引用元ウィキペディア
[編集] 起源
従来の育種学の延長で導入された1973年以降の遺伝子組換えの手法としては放射線照射・重イオン粒子線照射・変異原性薬品などの処理で胚の染色体に変異を導入した母本を多数作成し、そこから有用な形質を持つ個体を選抜する作業を重ねるという手順で行われた。最初のGMOが作成された後に科学者は自発的なモラトリアムをその組み換えDNA実験に求めて観測した。モラトリアムの1つの目標は新技術の状態、及び危険性を評価するアシロマ会議のための時間を提供することだった。生化学者の参入と新たなバイオテクノロジーの開発、遺伝子地図の作成などにより、作物となる植物に対して、「目的とする」形質をコードする遺伝子を導入したり、「問題がある」形質の遺伝子をノックアウトしたりすることができるようになった。米国では研究の進展とともに厳しいガイドラインが設けられた。そのようなガイドラインは後に米国国立衛生研究所や他国でも相当する機関により公表された。これらのガイドラインはGMOが今日まで規制される基礎を成している。
初めて市場に登場した遺伝子組み換え作物と言われるのは、アンチセンスRNA法（mRNAと相補的なRNAを作らせることで、標的となる酵素の産生を抑える手法）を用いて、ペクチンを分解する酵素ポリガラクツロナーゼの産生を抑制したトマトFlavr Savrである。他のトマトと比較して、熟しても皮が柔らかくなりにくいという特徴を持つ。
[編集] 分類
遺伝子組換え植物として開発されているものは、植物自体の研究に用いられるモデル植物として利用されているものと、産業的に利用されている、もしくは産業的利用を目指して研究されている遺伝子組換え作物に分けることができる。更に、遺伝子組換え作物は、非食用作物、食用作物(遺伝子組換え食品)、飼料用作物などに分類可能である。なお、食用作物と飼料用作物との境界は明確ではないため、それらを遺伝子組換え食品の範疇に含めて説明する。また、食用作物と飼料用作物はエタノール生産や燃料用油生産に利用されることもある。
[編集] 非食用遺伝子組換え作物
非食用の遺伝子組換え作物としては、園芸作物と林木が主である。園芸作物としては花卉が主体である。例えば、青いカーネーション「ムーンダスト」は、一般の消費者に花屋で売られている遺伝子組換え作物である。また、2009年に市販が予定されている青いバラ (サントリーフラワーズ)も遺伝子組換え作物である。その他、菊のカロテノイド含量を変化させたり、トレニアのアントシアニン生合成系をオーロン生合成系へ変化させて黄色いトレニアの花を作ったりする試みがある。林木の例としては製紙用にリグニンの構造や含量を改変されたポプラやヤマナラシやユーカリやテーダマツが多い。 なお、食用作物と飼料用作物がエタノール生産や燃料用油生産に利用されることもあるが、バイオエタノールやバイオディーゼル用に非食用植物を分子育種する研究が進んでいる。
[編集] 遺伝子組換え食品の分類
遺伝子組換え作物のうち食用に用いられる遺伝子組換え食品の分類としては、現在、第一, 二世代までに関して、ほぼ以下のように受け取られている。しかし、第三世代に関してはまだ確たる定説はない。
第一世代・・除草剤耐性、病害虫耐性、貯蔵性増大、など
第二世代・・成分改変食品で消費者の利益が強調されたもの。
第三世代・・過酷な環境でも成育できたり、収量が高かったりするような作物か？
[編集] 第一世代組換え食品
第一世代組換え食品に関しては、生産者や流通業者の利点ばかり強調されているきらいがあり、消費者にとって安価で安全な食品が安定供給される一助になるという最大のメリットが無視される傾向がある。農薬使用量の減少や不耕起栽培に利用できるなど環境面での負荷を減少させていることは、もっと強調されるべきことであろう。
[編集] 除草剤耐性作物
第一世代組換え作物としては、ラウンドアップやビアラホス(bialaphos)など特定の除草剤に耐性を持つ品種を作成し、その除草剤による雑草防除を利用するような作物も開発されている。これは農作業の効率化だけではなく、土壌流出による環境破壊を防ぐ不耕起栽培を適用できる。ダイズの主要生産国である北米や南米諸国では表土流出が大問題となっている。前作の植物残渣を放置できるため、植物残渣がマルチとなって風雨から土壌流出を防ぎ、土壌を耕すことによって土壌が流亡しやすくなることを不耕起栽培によって防ぐことができる(有井 彩, 山根 精一郎 2006. 除草剤耐性遺伝子組換え作物の普及と問題点 . 雑草研究 51, 263-268)。その他、有毒雑草の収穫物への混入を減らせるとの主張もある。
ラウンドアップ耐性作物に関しては、ラウンドアップの項を参照。ビアラホス耐性作物に関しては以下に記す。ビアラホスはIgnite/Basta、 Glufosinate、Herbiace等の名称で販売されている。放線菌 Streptomyces hygroscopicus, S. viridochromogenesなどが生産する抗生物質であり、窒素代謝においてアンモニウム・イオンの同化に関与するグルタミン合成酵素(グルタミン・シンテターゼ: glutamine synthetase)の阻害剤として作用する。グルタミン合成酵素の阻害剤として実際に作用するのは、ビアラホスから2分子のアラニン残基が遊離したホスフィノスリシン(phosphinothricin)である。グルタミン合成酵素が阻害されると毒性の高いアンモニウム・イオンが植物体内に蓄積して、植物体を枯死させると考えられている。ビアラホス生産菌は、自己防御のためにビアラホスを無毒化する酵素phosphinothricin N-acetyltransferase (PAT)の遺伝子barを持っている。そこでbarを植物内で発現できるように改変して植物に導入されている。
[編集] 害虫抵抗性作物
更に、害虫に対して毒性を有するタンパク質を生産させることで、害虫の発生を抑える害虫耐性のものも存在する。その機構としては、
Bacillus thuringiensisの結晶性タンパク質の遺伝子導入
トリプシン阻害剤（マメ科植物由来のタンパク質）の 遺伝子導入
インゲン豆由来のα-アミラーゼ阻害剤（タンパク質）の遺伝子導入
昆虫の外骨格であるキチン(chitin)を分解するキチナーゼ(chitinase)の遺伝子導入
が挙げられるが、特にBacillus thuringiensisの結晶性タンパク質(Bt toxin)遺伝子導入による害虫抵抗性作物が成功している。Bt toxinのBはBacillusの頭文字に、tはthuringiensisの頭文字に由来する。B. thuringiensisの性質として、
土壌細菌で芽胞を形成するときに結晶性タンパク質を蓄積する。
結晶性タンパク質が昆虫の腸に達すると部分消化され、殺虫性毒素ペプチドが遊離する。
哺乳類には殺虫性毒素ペプチドと結合する特異的な受容体がないため、毒性を発揮できない。
菌株によって生産する結晶性タンパク質が作用する昆虫の種類が異なる。
というものがある。Bt toxinは哺乳類には毒性を持たないため、Bt toxinを生産する植物を人間が食べても害はない。そこでBt toxinを生産する害虫耐性組換え作物の開発に繋がった。生産株の違いによりBt toxinには様々な種類がある。その種類により、殺虫スペクトルが異なってくる。そのため、作物に導入されたBt toxin遺伝子の種類により、殺虫活性を示す昆虫が異なる。Bt作物の導入により、
殺虫剤使用量の大幅削減
組織内へ侵入済みの害虫にも作用
害虫以外への殺虫剤による影響の大幅低下
虫害による傷口からの糸状菌感染症が著しく低下し、また収量増加の効用。
その結果としてカビ毒(mycotoxin)の含量(フモニシン:fumonisin、アフラトキシン:aflatoxin等の総量)の低下。
という結果が得られている。なお、他の殺虫剤と同様にBt toxin抵抗性害虫の発生も報告されている。
[編集] 耐病性作物
第一世代組換え作物として耐病性を有するものも作られている。病害抵抗性遺伝子やキチナーゼ遺伝子やディフェンシン遺伝子の導入によるものであるが、その中でも植物ウイルス耐性のものが特に成功している。植物ウイルスによる被害の大きい、ジャガイモなどの栄養繁殖性作物や果樹などの永年性作物に植物ウイルス耐性を付与することは農業上重要である。植物ウイルス耐性を与える手法としては様々な機構が用いられているが、その手法は少なくとも3種類挙げられる。
先ず1つ目は、decoatingの阻害である。植物ウイルスが植物細胞内に侵入してゲノムを複製させたりゲノムにコードされているタンパク質を生産させるためには外皮タンパク質(coat protein)を脱ぐこと(decoating)が必要である。もし、侵入した細胞内で外皮タンパク質が大量に存在している場合、decoating してもすぐに外皮タンパク質に覆われて(recoating)、植物ウイルスのゲノムはウイルスのゲノムの複製やタンパク質の翻訳に必要な酵素やリボソームと接触できず、ゲノムの複製や翻訳が阻害される。そこで植物細胞に植物ウイルスの外皮タンパク質の遺伝子を導入して大量に生産させてdecoatingを阻害する手法が用いられている。
二つ目の手法ではPTGS(post-transcriptional gene silencing)という機構を利用する。多くの植物ウイルスのゲノムはRNAであり、二本鎖RNAの形成が必要である。そのウイルスのRNAと相同性のあるRNAが発現されるように改変された形質転換植物は、対応するウイルスに対して、PTGSと同様の機構により、dicerやsiRNA(short interfering RNA)やRISC(RNA-induced silencing complex)などを通じてウイルスの二本鎖RNAの分解が行えるようになり、植物ウイルスに耐性になる。これはRNAiの一例といえる。
3つ目に、植物ウイルスのゲノムの複製に必要なreplicaseの変異型遺伝子の導入による耐性化も利用されることがある。外皮タンパク質過剰発現による植物ウイルス耐性の遺伝子組換え作物の例としてハワイのpapaya ringspot virus (PRSV)耐性遺伝子組換えパパイヤがあげられる。PRSVによってほぼ壊滅したハワイのパパイヤ栽培は遺伝子組換えパパイヤ品種によって復活できた。
[編集] 果実の収穫適期の拡大と保存性の向上
果実等の収穫適期には時間的に範囲が狭いものがある。特に、トマトなどでは色付き始めたらすぐに収穫して流通に乗せる必要性が高い。そうしないと店頭に並ぶ頃には過熟状態になったり、ケチャップやピューレなどへの工業的加工過程に入る前に傷口から腐敗したりして商品価値が低下することが多くなる。そこで、熟しても果皮が柔らかくならない様に細胞間を充填しているペクチン(pectin)を分解する酵素ポリガラクチュロナーゼ(polygalacturonase)の生産をアンチセンスRNA法などのRNAiの技法で抑制したFlavr Savrなどのトマトが開発された。
現在では、果実が熟する過程でポリガラクチュロナーゼの発現が誘導されるため、果実の熟する過程を制御する方向の研究が進んでいる。果実の熟する過程には、植物ホルモンの一種であるエチレンが関与している。そこで、エチレンの生合成を抑制する研究が進んだ。エチレンの生合成系は、S-アデノシル-L-メチオニン(S-adenosyl-L-methionine : SAM)から、ACC合成酵素(ACC synthase)の作用により1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(1-amino cyclopropane-1-carbonic acid :ACC)が合成され、ACCからACC酸化酵素(ACC oxidase)によってエチレンに変換されるというものである。(SAM -> ACC -> エチレン)そこで、この過程の酵素、ACC合成酵素やACC酸化酵素をアンチセンスRNA法やコサプレッション法などのRNAiの技法で抑制すれば、エチレンの生合成が抑制されるわけである。その他に、土壌細菌Pseudomonas chlororaphis由来のACCデアミナーゼ(ACC deaminase)遺伝子の導入によって、ACCを2-オキソ酪酸(2-oxobutylate)とアンモニアに分解することによってエチレン合成が抑制されたトマトも開発されている。ACCデアミナーゼ遺伝子が導入されたトマトは室温で収穫後121日放置しても瑞々しい状態であった(Harry J. Klee, Maria B. Hayford, Keith A. Kretzmer, Gerard F. Barry, and Ganesh M. Kishore, Control of Ethylene Synthesis by Expression of a Bacterial Enzyme in Transgenic Tomato Plants, The Plant Cell, Vol. 3, 1187-1 193, November 1991)。
エチレン合成が抑制されたトマト果実は出荷前に倉庫でエチレン処理をすると正常な熟する過程を開始し、色付き、果皮も柔らかくなる。エチレンによる果実の追熟は多くの果実で取り入れられており、この原理は、バナナやマンゴーなどの熱帯輸入果実は、害虫移入防止のため未熟果実を輸入しエチレンによって追熟しているのと同じである。そのため、その設備を利用できる。また、家庭においてもキウイフルーツを追熟させたい場合、エチレンをよく発生するリンゴと同じビニール袋に入れて保存するのも同じ原理である。
[編集] 第二世代組換え食品
第二世代に関しては、ワクチン等の有用タンパク質の工場として利用することができたり、栄養素を多く含ませたり、食品中の有害物質を低減させたり、消費者にとって利益が目に見えるものである。例えば、B型肝炎予防の食べるワクチンとしてB型肝炎ウイルスの表面抗原をバナナで発現させ経口免疫によってB型肝炎感染を防除する試みがある(Planta, vol. 222, No. 3, p. 484-493, October 2005)。また、日本においてはインシュリンを分泌誘導して糖尿病になりにくくするコメやスギ花粉症を低減するコメの開発が先行している。
[編集] オレイン酸高含有遺伝子組換えダイズ
現在、いわゆる第二世代の組換え作物として商業栽培されているものの一つにオレイン酸高含有ダイズがある。一般的なダイズ油中の不飽和脂肪酸残基の組成はリノール酸(18:2)(約50%)、オレイン酸(18:1)(約20%)、リノレン酸(18:3)(約10%)である。一方、オレイン酸高含有遺伝子組換えダイズ油(高オレイン酸ダイズ油)には約85%のオレイン酸が含まれ、リノール酸やリノレン酸などの多価不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids : PUFAs)残基が少ない。これはオレイン酸からリノール酸への不飽和化に関与している酵素ω6-desaturase (FAD2)の遺伝子(FAD2)の発現を抑制することによってオレイン酸の含量を高めている。オレイン酸のような1価不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid)を多量に含む油脂は血中の高密度リポ蛋白質(high density lipoprotein : HDL)の比率を増やして、動脈硬化を防止すると考えられている。更に、オレイン酸はPUFAsに比べ酸化に安定である。そのため、高オレイン酸ダイズ油は揚げ油などに適している。
[編集] ゴールデンライス
その他、第二世代の組換え作物として最も有望視されているものがゴールデンライス(golden rice)である。ビタミンA(vitamin A)欠乏は多くの発展途上国において乳幼児の深刻な問題になっている。その解決策としてビタミンAの前駆体であるβ-カロテン(β-carotene)を内胚乳に含有するゴールデンライスが開発された。β-カロテンを含有するため精米された米が黄色を呈するのでゴールデンライスと命名された。ゴールデンライス自体を主食としてもビタミンAの必要量を満たさないと非難する考えが遺伝子組換え食品反対派にあった。しかし、2005年には、新たにゴールデンライス2が発表され、これだけを摂食することでビタミンAの必要量がまかなえるようになった。これはカロテノイド生合成系遺伝子としてゴールデンライスで用いられていたスイセン由来のフィトエン合成酵素(phytoene synthase)のcDNAの代わりにトウモロコシやイネ由来のcDNAを利用することにより達成された(Nature Biotechnology 2005 Apr;23(4):482-7)。
[編集] 作製法
遺伝子組換え植物を作製する上で、植物のホスト(宿主)・ベクター系(host-vector system)が必要とされる。そのホスト・ベクター系を構築する上で以下の4種類の系が必要とされる。
植物細胞への遺伝子の導入系(導入系)
遺伝子の組換わった細胞（形質転換細胞）だけを選択するための系(選択系)
導入した遺伝子を複製させ、細胞分裂後にも伝達させるための系(複製系)
単一の細胞から植物個体まで再生させるための系(分化・再生系)
これらについて以下の節で簡単に説明する。
[編集] 導入系
導入系とは、目的とする遺伝子を細胞の遺伝子が発現する場所に導入するための系である。遺伝子を導入・発現させるための植物細胞内の小器官として、現在、核とプラスチド(plastid)が標的となっている。導入系にはいろいろな手法があるが、現在の主要な方法は、パーティクルガン法とアグロバクテリウム法であり、それぞれについて簡単に説明する。
[編集] パーティクル・ガン法
パーティクル・ガン法を参照のこと。
[編集] アグロバクテリウム法
Agrobacterium tumefaciens :(正式名称 Rhizobium radiobacter )が主に用いられている。自然界ではA. tumefaciensは、双子葉植物を宿主としてクラウンゴール(crown gallまたはcrowngall)という腫瘍を形成させ、それをA. tumefaciensは資化できるが植物は資化できないオピン(opine)という特殊なイミノ酸を生産する工場としている。これを生物学的植民地化という。これはA. tumefaciensに含まれるTi (tumor inducing) plasmidのT-DNA (transferred DNA)が植物細胞の核ゲノムに導入されたことによって生じる。そこで、このDNA導入機構を利用して植物への遺伝子導入方法が開発された。そのうち、現在はバイナリー・ベクター(binary vector)法が主流である。これは、Ti plasmidの本来のT-DNAを除去されたvir helper Ti plasmidと、大腸菌とA. tumefaciensの双方で利用できる小型のシャトル・ベクター(shuttle vector)に人工のT-DNAを付与したものとで構築されている。vir helper Ti plasmidには、本来のT-DNAが存在しないため、植物にクラウンゴール(腫瘍)を形成できないが、T-DNAを植物ゲノムに導入するために必要なvir領域が存在しているため、他のプラスミド上に存在する人工T-DNAを植物に導入できる。このように同一のDNA上に存在しなくても、作用しあえる遺伝子間の関係をトランスという。以下に、バイナリー・ベクター法を簡単に説明する。
A. tumefaciensに存在するTi plasmidは巨大プラスミドであり、これをA. tumefaciensから直接単離し試験管内で操作することは困難である。一方、Ti plasmid上にはvir領域という、T-DNAを植物ゲノムに導入するために必要な遺伝子群が存在するので、Ti plasmidは植物への遺伝子導入には必要である。しかし、本来のT-DNAは植物を腫瘍化するので不要である。そこで、本来のT-DNAが欠損したがvir領域を保持したままのvir helper Ti plasmidとそれを保持するA. tumefaciensの菌株が開発された。A. tumefaciensの染色体上にも、植物への遺伝子導入に必要とされる遺伝子が存在するために、更にTi plasmidの宿主としてもA. tumefaciensはアグロバクテリウム法において必要とされる。
T-DNAの両末端にはRB(right border)とLB(left border)という短い配列が存在している。RBとLBに挟まれた配列が植物に導入され、その間の配列には特異性がないため、植物に導入したい遺伝子や形質転換植物を選択するための選択マーカー遺伝子をRBとLBに挟みこんで人工のT-DNAを構築できる。
更に、vir領域とT-DNAとの作用関係はトランスであり、両者が同一のプラスミド上に存在している必要が無い。そこで、小型のシャトル・ベクターに人工のT-DNAを付与したものを試験管内で改変した後に大腸菌を用いて増幅させる。その後、A. tumefaciensへ導入して、A. tumefaciens内でvir helper Ti plasmidと共存させて植物に人工のT-DNAを導入させている。この小型のシャトル・ベクターは、大腸菌の複製開始点と広範囲のグラム陰性菌の間で複製可能な複製開始点が存在する広宿主域ベクターであり、また、植物の形質転換の選択に用いられる選択マーカー遺伝子(人工のT-DNA部分内に存在)以外にも、大腸菌とA. tumefaciensの形質転換体の選択に用いられる選択マーカー遺伝子を別に保持している。
A. tumefaciensの本来の宿主は双子葉植物であるが、vir領域の転写のインデューサー(inducer)であるアセトシリンゴン(acetosyringone)の利用やvir領域の転写活性が恒常的に高いhypervirulent helper Ti plasmidの開発により、イネなどの単子葉植物などへの応用が可能となってきている。
アグロバクテリウム法は、パーティクルガン法に比べ高価な機材は必要なく、また、ランニングコストも低い。T-DNAは植物の核ゲノムに1~2コピー程度の低コピー数で導入されることが多い。一方、アグロバクテリウムの感染後にアグロバクテリウムを除去するなどの煩雑な操作が必要であり、アグロバクテリウムの感染効率も材料の種類や状態によって様々である。
[編集] 選択系
多数の細胞を材料として、それらに遺伝子導入を試みても、それらの中から極少数の形質転換体しか得られないことが多い。そのため、形質転換体のみを特異的に選択する選択マーカー遺伝子を目的遺伝子以外に同時に導入する必要がある。選択マーカー遺伝子の性質としては、形質転換細胞のみが生存・増殖できるポジティブ選択可能であり、更に形質転換細胞と非形質転換細胞とが混在しあったキメラ(chimera)を形成しにくいことが望ましい。多くの場合、アミノグリコシド系抗生物質のカナマイシン(kanamycin)やG418やハイグロマイシンB(hygromycin B)などの耐性遺伝子が遺伝子組換え作物にも用いられてきたが、現在では後述の新しい選択マーカー遺伝子やマーカー除去の技術が用いられるようになった。
[編集] 複製系
導入された遺伝子が植物細胞の細胞分裂にあわせて複製されなくては、一過性の遺伝子発現(transient gene expression)となって、安定した形質転換植物を得ることができない。そこで外来遺伝子の複製系が必要となる。現在、植物の場合は外来遺伝子が植物の核ゲノムに挿入されて、核ゲノムの複製にあわせて一緒に複製される様にすることが主流である。また、プラスチドのDNAと外来遺伝子を相同組換えによって導入する系も存在する。
[編集] 分化・再生系
外来遺伝子が導入された単一の形質転換細胞より植物個体を分化・再生する系である。多くの場合、オーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンの濃度比を変えることによって植物個体を再生させている。しかし、材料の状態や培養開始からの時間や材料の成熟度などによって大きく変化する。多くの場合、カルスを経てカルスからシュートが分化してくる。そのシュートを発根培地に植え継いでから馴化して鉢上げする。なお、シロイヌナズナ(アラビドプシス: Arabidopsis thaliana)などにおいては、未熟な花蕾をアグロバクテリウム溶液につけるfloral dip法や、花蕾にアグロバクテリウム溶液を噴霧したりするfloral spray法においては、それらの処理後に種子を得て、それらの中から形質転換体を選択する。つまり、種子を発芽させて選択するだけなので再生系は必要とされない。
その他、カルスなどの未分化な状態での形質転換植物を培養することが目的の場合には、分化・再生系は必要とされない。
[編集] 植物の形質転換操作手順
[編集] パーティクルガン法による手順
パーティクルガン法による一般的な形質転換植物を得る操作手順の例を簡単に示す。
植物に導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子が存在するDNAとよく懸濁した金の微粒子とを混和してエタノール沈殿を行う。
遠心分離により回収されたDNAでコートされた金の微粒子を風乾し、パーティクルガンにセットする。
無菌的植物もしくは滅菌した植物の葉の断片や茎の断片などの組織片をシャーレの中の固体培地上に置床してパーティクルガンにセットしてから、金の微粒子を打ち込む。
植物組織をカルスを誘導する植物ホルモンも含む選択培地に植え継ぎ、選択培地上で増殖するカルスを選択する。
増殖したカルスをシュート分化用の植物ホルモンも含む選択培地に植え継ぎ、シュートを分化させる。
カルスからシュートを切除して、シュートを発根用の選択培地に植え継ぎ、発根した後に鉢上げして馴化する。
カルスが形成された後の各段階で遺伝子の導入を確認する。
[編集] アグロバクテリウム法による手順
バイナリー・ベクターを用いたアグロバクテリウム法による一般的な形質転換植物を得る操作手順の例を簡単に示す。
小型プラスミドのシャトル・ベクター上のT-DNA部分に目的遺伝子を挿入する。T-DNA部分には選択マーカー遺伝子も含まれている。
組換わったプラスミドを大腸菌に導入して、大腸菌中で増やしてから回収し、挿入遺伝子を確認する。
回収したプラスミドを電気穿孔(エレクトロポーレイション: electroporation)法や三親接合伝達法などを利用してvir helper Ti plasmidを含むA. tumefaciensへ導入する。その際、シャトル・ベクター上のバクテリアでの選択マーカー遺伝子を利用してシャトル・ベクターが導入されたA. tumefaciensを選択する。
選択したA. tumefaciensを液体培地で増殖させて集菌し、共存培養培地に懸濁する。
無菌的植物もしくは滅菌した植物の葉の断片や茎の断片などの組織片をシャーレの中に移し、A. tumefaciensと共存培養する。この際に、アセトシリンゴンなどを添加すると感染効率が上昇する。
共存培養が終わった植物組織片をカルスを誘導する植物ホルモンも含む選択培地に植え継ぎ、選択培地上で増殖するカルスを選択する。この培地には、A. tumefaciensを除菌するためのカルベニシリンなどの抗生物質が含まれている。
増殖したカルスをシュート分化用の植物ホルモンと除菌用抗生物質も含む選択培地に植え継ぎ、シュートを分化させる。
シュートを切除して、除菌用抗生物質も含む発根用の選択培地に植え継ぎ、発根した後に鉢上げして馴化する。
カルスが形成された後の各段階で遺伝子の導入を確認する。
[編集] 新しい選択マーカー遺伝子
現在の遺伝子組換え手法において、多数の細胞を材料としてその中から極少数の形質転換細胞を選択する操作が用いられることが多い。そのため、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子の発現を指標として形質転換体を選択している。この植物の選択マーカー遺伝子は組換え作物においてもカナマイシン(kanamycin)などのアミノグリコシド(aminoglycoside)系抗生物質に耐性を与える遺伝子が用いられることが多かった。そこに、社会政策的な問題が形質転換植物の選択系にも影響をおよぼした。EUは2004年末をもって医療用、家畜用に用いられる抗生物質に対する耐性遺伝子で形質転換植物細胞の選択を禁止した。そして、今後、EUで販売される遺伝子組換え植物や食品は他の選択マーカー遺伝子が用いられているか、選択マーカー遺伝子が除去されていなくてはならないとした(European Parliament 2001)。形質転換植物の選択マーカー遺伝子は基本的には形質転換体の選択という育種の極初期に用いられるに過ぎない。
しかし、遺伝子組換え食品反対派は、組換え作物が持つカナマイシン耐性遺伝子(NPTII: aminoglycoside (neomycin) phosphotransferase遺伝子) やハイグロマイシンB耐性遺伝子(hpt: hygromycin phosphotransferase遺伝子)などの抗生物質耐性遺伝子が腸内細菌に極低い頻度であっても取り込まれる可能性があるとし、これを批判の根拠の一つとしていた。そこで、除草剤として用いられているビアラホス(bialaphos: phosphinothricinとして作用)の様な農業用抗生物質を除いて医療用・畜産用抗生物質の耐性遺伝子の選択マーカーとしての利用を規制したわけである。
その結果、新たな選択マーカー遺伝子を用いた選択系が用いられるようになった。その中には、植物の利用できない炭素源を資化または解毒できるようにするものがある。
D-amino acid oxidase (DAAO)：DAAOは赤色酵母Rhodotorula gracilis由来のDAO1にコードされているものを利用。多くのD-アミノ酸(D-amino acids)をα-ケト酸(α-keto acids: 2-オキソ酸(2-oxo acids))に変換できる。D-アラニン(D-Ala), D-セリン(D-Ser)は毒性を持ち、DAAOによって解毒されるため、形質転換体をpositive selectionできる。(D-Alaからピルビン酸(pyruvate), D-Serから3-ヒドロキシピルビン酸(3-hydroxy pyruvate)へ解毒、α位の炭素の光学活性が無くなる。)。D-イソロイシン(D-Ile), D-バリン(D-Val)の毒性は低いが、それらのα-ケト酸は毒性を持つ。そのため、部位特異的な組換えによりDAO1が形質転換体から除去された組換え体をnegative selection可能である。
phosphomannose isomerase (PMI): フルクトース-6-リン酸(fructose-6-phosphate)は解糖系の中間体であり、マンノース-6-リン酸(mannose-6-phosphate)をフルクトース-6-リン酸へ変換できれば唯一の炭素源として資化できることになる。多くの植物はPMIを所持せず、マンノース-6-リン酸をフルクトース-6-リン酸へ変換できない。そのため、選択培地中にマンノース(mannose)を唯一の炭素源とした場合、資化できないが、大腸菌Escherichia coli由来のPMI遺伝子pmiを導入された形質転換体はマンノースを解糖系へ導入できるため、生育可能となる。なお、培地から取り込まれたマンノースは植物のヘキソース・キナーゼ(hexose kinase)(ヘキソキナーゼ: hexokinaseとも記述される)によってマンノース-6-リン酸へ変換される。
D-arabitol-4-dehydrogenase: 植物にD-arabitol資化能を導入する。
その他、選択マーカー遺伝子を除去する系を利用するものもある。
co-transformation: 抗生物質耐性などの選択マーカー遺伝子と目的遺伝子を別々のDNA断片として導入して、選択マーカー遺伝子で選択した形質転換体の中から目的遺伝子と選択マーカー遺伝子が植物細胞のゲノムの別々の部位に組み込まれたものを選択して、後代をとり目的遺伝子を持つが選択遺伝子を持たないものを選択するというもの。外来遺伝子を取り込む能力を持つコンピテントセル(competent cell)が限られていることを利用する手法である。
MAT vector法: 日本製紙株式会社の開発したMulti-Auto-Transformationの略である。いろいろなタイプがあるが、サイトカイニン(cytokinin)合成遺伝子(iptZ)と醤油酵母Zygosaccharomyces rouxiiの内在性プラスミドpSR1の部位特異的組換え酵素とその標的配列を順方向反復配列(direct repeats)として利用しているものの説明をする。植物ホルモンの一種であるサイトカイニンは頂芽優勢を打破するために、サイトカイニンが多いと側芽が次々伸びて多芽体を植物は形成する。iptZと部位特異的組換え酵素遺伝子を標的配列の順方向反復配列で囲み、その外側に目的遺伝子を配置したDNAを植物細胞に導入すると、サイトカイニンが過剰生産され、多芽体が形成される。その中から、部位特異的組換え酵素遺伝子が標的配列の順方向反復配列に作用してiptZと部位特異的組換え酵素遺伝子が除去され、目的遺伝子が残ったものが正常な頂芽優勢を示す表現型のものとして得られる。それを目的遺伝子のみを所持するものか検定して、確認する。
[編集] 新技術(ジーンターゲッティング)の導入
その他、現在、ジーンターゲッティング法を用いて遺伝子置換を植物に応用する試みが進んでいる。植物は相同組換え活性が低く、内在性の遺伝子と相同性が高いDNA断片を導入しても内在性の遺伝子と殆ど相同組換えを起こさず、非相同組換えによって標的以外に組み込まれるものが大部分である。そこで様々な工夫が必要となる。
[編集] ALS遺伝子の特異的置換
ひとつの例が、pyrimidinyl carboxy系除草剤であるbispyribacへの耐性を示すイネの開発である。この除草剤は、分岐鎖アミノ酸(blanched chain amino acids, BCAA)生合成系の酵素の一種であるacetolactate synthase (ALS)の阻害剤である。イネのある変異体は、ALSの2カ所のアミノ酸残基の変異によってbispyribacに対して高度に耐性を示す。そこで、非相同組換えによる耐性形質転換体を除去するためにpromoterとN(アミノ)末端側の配列を欠失したイネ由来の変異型ALSをイネに導入して耐性になった相同組換えによる遺伝子置換体を単離した。そのhomo接合体は著しくbispyribacに対して耐性となっていた(The Plant Journal (2007) 52, 157–166)。
この過程で変異型ALSのpromoterとN末端側の配列を欠失したものを用いているのは重要である。promoterとN末端側の配列を含む完全な変異型ALSを用いればゲノムの本来のALS以外のところに非相同組換えによって挿入されてもbispyribac耐性になってしまう。また、promoterのみを除去し開始コドンから完全な変異型ALSのタンパク質コード領域(翻訳領域、ORF)を含んでいるものを用いれば、ほとんどの非相同組換えによるbispyribac耐性株を除去できるはずであるが、T-DNA taggingに用いられているようにAgrobacterium(アグロバクテリウム)法ではT-DNAはかなりの高頻度で転写活性の高い領域に挿入されるため、何らかの遺伝子のpromoter下流に挿入され、その転写方向と挿入断片のセンス鎖方向が一致すればbispyribac耐性株が生じる可能性がある。そこで、promoterとN末端側の配列を欠失したものを用いれば非相同組換えによるbispyribac耐性形質転換体によるバックグラウンドをほぼ排除できるわけである。
この遺伝子置換体は基本的に標的となったALSの配列のみが野生型と一部異なるだけであり、他の選択マーカー遺伝子が存在しないため、突然変異により育種されたものと区別がつかない。このことは遺伝子組換え食品の実質的同等性を確保する上で大きな意味を持つ。
