mRNAワクチンによる免疫活性化の新たなメカニズム
















研究論文|2021年11月15日
最先端：COVIDスパイクタンパク質を含む循環エクソソームがBNT162b2（Pfizer-BioNTech）ワクチン接種により抗体発現前に誘導される： mRNAワクチンによる免疫活性化の新たなメカニズム 



要旨
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、重症急性呼吸器症候群の原因となる。 SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を標的としたmRNAワクチンにより、Absと防御免疫が発現した。そのメカニズムを明らかにするため、我々は健常人へのワクチン接種後、SARS-CoV-2スパイクタンパク質とAbによる循環エクソソームの誘導の動態を解析した。その結果、ワクチン接種後14日目にスパイク蛋白を発現する循環エクソソームが誘導され、次いで2回目の接種から14日後にAbsが誘導された。スパイクタンパク質を含むエクソソーム、SARS-CoV-2スパイクに対するAbs、およびIFN-γとTNF-αを分泌するT細胞は、ブースター投与後に増加した。エクソソームの透過型電子顕微鏡観察では、その表面にスパイクタンパク質のAgも確認された。スパイク蛋白質とAgを含むエクソソームは、4ヵ月後には並行して減少した。これらの結果は、mRNAベースのワクチン接種後の効果的な免疫化には、スパイクタンパク質を含む循環エクソソームが重要な役割を果たすことを示している。このことはさらに、スパイクタンパク質を有するエクソソームで免疫したマウスにおいて、体液性免疫応答および細胞性免疫応答が誘導されたことによって証明された。


はじめに
コロナウイルス感染症2019（COVID-19）のパンデミックは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる。軽症の感染者のほとんどは自然に回復するが、SARS-CoV-2感染は機械的人工呼吸を必要とする重症急性呼吸器疾患を引き起こし、死亡率は約1％である。免疫を誘導し、SARS-CoV-2感染の重症度を軽減するために、いくつかのカテゴリーのワクチンが開発されている(1, 2)。疾病管理予防センターによる最近の最新情報によると、SARS-CoV-2患者の死亡率は、18-29歳と比較して30-39歳では4倍、85歳以上では600倍となっている。(出典：https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/investigations-discovery/hospitalization-death-by-age.html）


Pfizer-BioNTech社とModerna社が開発したSARS-CoV-2ウイルス感染に対するmRNAベースのワクチンが、米国食品医薬品局（FDA）より緊急使用許可を得た（3-5）。これらのワクチンは、体液性および細胞性免疫応答を発達させることにより、SARS-CoV-2感染から被接種者を保護する。ワクチン接種の有益な効果は、スパイク蛋白に対するAb反応を測定することによって決定されることが多い(6)。今回の研究では、SARS-CoV-2ワクチン（Pfizer-BioNTech社製）の2回接種を受けた8人の健康成人を分析した。その結果、SARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsが血清から検出されなくなった14日目までに、SARS-CoV-2スパイク蛋白を含むエクソソームが循環していることが示された。
循環Absは、ワクチンの2回目のブースター投与（14日目）後にのみ検出可能であり、スパイクタンパク質を含むエクソソームの量は最大約12倍まで増加した。これらの結果は、エクソソームの誘導が免疫後の免疫応答に重要な役割を果たすことを強く支持している。このことは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をワクチン接種した個体由来のエクソソームをマウスに免疫したところ、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に特異的なAbsが発現したことからも、さらに支持される。


材料と方法
患者コホートと人口統計
mRNAベースのSARS-CoV-2ワクチン（Pfizer-BioNTech社製）を接種した健康な成人ボランティア8名を解析した。ワクチン接種前、1回目接種後7日目と14日目、2回目接種後14日目、両ワクチン接種後4ヵ月目に血液を採取した。本研究は、聖ヨゼフ病院の施設審査委員会（IRB）により承認された（IRB番号PHXB16-0027-10-18）。

エクソソームの単離とナノ粒子追跡分析
エクソソームは、Invitrogen Exosome Isolation Kitを用いて500μlの血漿から単離し、0.22ミクロンのろ過を行った(7)。すべてのエクソソームはNanoSight NS300（Malvern Panalytical, Great Malvern, U.K.）で粒子径を分析し、実験に用いた粒子の平均粒子径は200 nm未満であった(8)。

ヒト血漿検体からのSARS-CoV-2スパイク蛋白およびヌクレオカプシド蛋白に対するAbsの検出

SARS-CoV-2スパイクAgに対するAbsの発現は、当研究室で開発したELISAを用いて測定した。簡単に説明すると、PBSに懸濁した1μg/mlのSARS-CoV-2スパイク蛋白（Sino Biological社製）をELISAプレートにコートし、4℃で一晩インキュベートした。このプレートにヒト血漿を1:750希釈で加えた。検出は二次抗ヒトIgG-HRP（1:10,000）を用いて行い、テトラメチルベンジジン基質を用いて現像し、450nmで読み取った。陽性対照として、SARS-CoV-2感染者（n＝10）および両用量のワクチンで免疫した健常者（n＝20）の血漿検体を用いた。SARS-CoV-2感染の既往がなく、SARS-CoV-2のワクチン接種を受けていない健常人（n＝20）を陰性対照とした。Ab濃度は、各Abの既知濃度から標準曲線を用いて算出した（Thermo Fisher Scientific）。

ウェスタンブロットを用いたエクソソームの特性解析
全
エキソソームタンパク質（15μg）をPAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ウェスタンブロットは(9)に記載されている方法で行った。標的タンパク質のバンド強度はImageJソフトウェアを用いて定量し、すべてのブロットをCD9で正規化した。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質の単離エクソソームの透過型電子顕微鏡観察
エクソソームをイムノゴールドとマウス抗SARS-CoV-2スパイクAbで標識し、コロナウイルスFIPV3-70 Ab（1:100）をグリッドに添加した。グリッドを洗浄後、酢酸ウラニルで染色し、透過型電子顕微鏡（JEOL USA, Peabody, MA）で観察した(10)。

SARS-CoV-2スパイク蛋白Agに対するヒトT細胞応答のELISPOT
血液はインフォームドコンセントを得た上で個人から採取し、IRB（IRB番号PHXB16-0027-10-18）の承認を得た。PBMCはFicoll-isopaque gradient separation（ICN Biomedicals, Aurora, OH）により分離し、凍結保存した。その後、これらのPBMCをELISPOTアッセイ用に処理した。


SARS-CoV-2抗原を含むエクソソームによるマウスの免疫
C57BL/6マウスに、SARS-CoV-2スパイク蛋白陽性ワクチン接種個体から分離したエクソソーム（ワクチン2回投与後14日目のエクソソーム）をs.c.免疫した。1）対照群（n＝5）、2）ワクチン接種後の健康な個体1匹から単離したエクソソーム（n＝5）、3）ワクチン接種後の健康な個体2匹目から単離したエクソソーム（n＝5）、4）SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫したマウス（n＝5）。動物は30日目に犠牲にし、ELISA用に血液を採取し、T細胞応答用に脾臓を採取した。

マウス血清中のSARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsの検出
SARS-CoV-2スパイクAgに対するAbsの発現は、前節に記載したようにELISAを用いて測定した。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質Agに対するマウス脾臓細胞応答のELISPOT
免疫後30日目にマウスの脾臓を採取し、脾臓細胞をFicoll-Hypaque勾配遠心分離により単離し、前述のようにELISPOTで分析した(9, 10)。
　
統計解析
データはPrism 8.0ソフトウェア（GraphPad）を用いて解析した。SARS-CoV-2スパイクタンパク質のAbレベルおよびSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含むエクソソームのODは、Wilcoxon順位検定を用いて比較した。動物実験の結果は、二元配置分散分析を用いて解析した。データは平均値とSDで表した。p値＜0.05は統計的に有意とみなした。

結果と考察
エクソソームの単離
我々の研究で使用された粒子の平均サイズは＜200 nmであり、国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles）のエクソソームサイズと一致した。エクソソームの代表画像を図1Aに示す。個体によってエクソソームの数に有意差はなかった。




(A)ワクチン接種者のエクソソームの代表的なNanoSight画像と平均サイズおよび中央値（グラフ中の黒い細線は同一サンプルの3つの測定値を示し、赤い線は3つの線の平均値）。(B）対照およびワクチン接種者のエクソソーム上のSARS-CoV-2スパイクAgの透過型電子顕微鏡像。矢印はSARS-CoV-2スパイク陽性エクソソームを示す。右側、3番目の画像はワクチン接種検体からの陽性エクソソームの拡大画像である（元の倍率×50,000）。両試料とも陰性コントロールとして抗コロナウイルスFIPV3-70 Abを用いた。

透過型電子顕微鏡により、ワクチン接種者から単離されたエクソソームにおけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質の表面発現が示された。

SARS-CoV-2スパイクに特異的なAbsを用いて透過型電子顕微鏡観察を行い、コントロールと健常なワクチン接種者から得られたエクソソームの表面にSARS-CoV-2 Agが存在することを証明した。ワクチン接種者のエクソソームはSARS-CoV-2 Ag陽性であった（図1B）。また、陰性対照としてコロナウイルスFIPV3-70 Abでエクソソームを染色したが、エクソソームでは陽性反応は観察されなかった（図1B）。

ワクチン接種者におけるSARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsの発現動態
SARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsは、ワクチン2回目接種14日目以降に健常者全員から検出され（平均濃度2401.25±773.45ng/ml）、ワクチン未接種およびワクチン1回目接種14日目と比較してp値＜0.0001であった。ワクチン接種4ヵ月後のAb濃度は1107.38±681.63ng/mlに減少した。この減少は、ワクチン2回目接種後14日目に発現したAbsと比較して有意に低い（p = 0.0313）（図2A）。


(A）ワクチン初回接種後0日目、7日目、14日目（14-1）、ワクチン2回目接種後14日目（14-2）、ワクチン2回目接種後4ヶ月におけるワクチン接種健常者のSARS-CoV-2スパイクAbレベル。(B）0日目、7日目、14-1日目、14-2日目、2回目のワクチン接種から4ヵ月後のエクソソーム蛋白SARS-CoV-2スパイク蛋白S2のウェスタンブロット。(C）ウェスタンブロットのデンシトメトリーと統計解析。(D）ワクチン接種14-1日目、14-2日目、および2回目のワクチン接種4ヵ月後における、ワクチン接種を受けた健常人のSARS-CoV-2スパイクAbのレベルの線図（E）ワクチン接種14-1日目、14-2日目、および2回目のワクチン接種4ヵ月後における、ワクチン接種を受けた健常人のSARS-CoV-2スパイクタンパク質のウェスタンブロットのデンシトメトリーの線図の前後。(F）健常人における2回目のワクチン接種後14日以内のエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイクタンパク質のウェスタンブロット。(G）ウェスタンブロットのデンシトメトリーと統計解析。(H）ワクチン2回接種後14日目の健常人におけるSARS-CoV-2スパイクAbのレベル。(I）SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するサイトカイン発現（TNF-αおよびIFN-γ）のELISPOT。すべてのグラフは、平均値とSD（縦棒グラフ）を用いた散布図である。CD9はすべてのブロットを正規化するために使用した。ウェスタンブロットとAb発現実験は、少なくとも3回、独立して行った。

ワクチン接種者から分離した循環エクソソームにはSARS-CoV-2スパイク蛋白質Ag S2が含まれていた。
ワクチン1回目投与後0日目、7日目、14日目、および2回目投与後14日目のワクチン接種健常者の血漿を分析し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を有するエクソソームの存在を確認した（図2B、2C）。その結果、投与1回目の14日目にエクソソーム上にSARS-CoV-2スパイクAg S2が存在することが示された。投与2の14日目にはスパイクタンパク質の濃度が有意に増加し、p値は0.0299であった。両ワクチン投与4ヵ月後のエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイクタンパク量は、2回目投与後14日目と比較して有意に減少し、p値は0.0078であった。異なる時点（1回目と2回目の投与から14日目、2回目の投与から4ヶ月後）における、各健常人のスパイク蛋白質に対するAb発現とスパイク蛋白質を含むエクソソームの動態を（図2D）に示す。Ab発現の動態とSARS-CoV-2スパイク蛋白エキソソームの量は、ともに14日目の2回目のブースター投与後に増加しており、互いに一致している（図2E）。2回目のブースター投与14日目から4ヶ月後まで、各健常者においてSARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbレベルとエクソソーム中のSARS-CoV-2スパイク蛋白の量が減少している（図2D、2E）。このサブセットに関する各個人のデータを補足図1および補足図2に示す。

健康なワクチン接種者のサイトカインIFN-γとTNF-αのレベルはコントロールと比較して高い
ワクチン接種を受けた健常人のSARS-CoV-2スパイク蛋白Agに対するT細胞応答をELISPOTを用いて解析した。サイトカインIFN-γおよびTNF-αを産生する細胞は、SARS-CoV-2スパイクAgに応答して、健常対照者と比較してワクチン接種を受けた健常者で有意に高かった（p = 0.0078）（Fig.） ヌクレオカプシドAgに反応してサイトカインのいずれかを産生するT細胞は増加しなかった。

SARS-CoV-2スパイクタンパクに対するAbsは、スパイクタンパクをワクチン接種した個体からのエクソソームで免疫すると、マウスでより高レベルのAbsが誘導された。

C57BL/6マウスにワクチンを接種した個体およびコントロールから単離したエクソソームを免疫した。しかし、完全ワクチン接種個体由来のエクソソームで免疫したマウスは、15日目にコントロールよりも有意に高いSARS-CoV-2スパイクAgに対するAbsを発現した（181.49 ± 37.02 対 64.44 ± 1.7; p < 0.0449）21日目（352.82 ± 128.82 対 20.84 ± 2.24; p < 0.0001）および30日目（372.34 ± 56.08 対 25.17 ± 1.08 p < 0.0001）（図3A）。SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫したC57BL/6動物もまた、SARS-CoV-2スパイクAbレベルの上昇を示した（図3A）。


(A）15日目、21日目および30日目にコントロールおよびワクチン接種個体由来のエクソソームでマウスを免疫した後の血清SARS-CoV-2スパイクのELISA。(B）30日目にコントロールおよびワクチン接種個体由来のエクソソームでマウスを免疫した後、SARS-CoV-2スパイクAgに応答する脾細胞におけるサイトカイン発現（IL-10、IL-17、TNF-α、およびIFN-γ）のELISPOT。グラフは、平均値とSD（縦棒グラフ）で表した。マウス実験は独立して少なくとも3回行い、各群でn=3またはn=5の動物を用いた。

ワクチン接種者のエクソソームで免疫したマウスの脾臓リンパ球でサイトカイン（IFN-γとTNF-α）レベルが高い。
ワクチン接種個体由来のエクソソームで免疫したマウスの脾臓リンパ球は、対照群と比較してサイトカイン分泌細胞数の増加を示した： IFN-γ（853.77±517.84対340.36±38.78）およびTNF-α（568.25±327.72対102.14±19.06）のスポット数は100万個あたり増加したが、その差は統計学的に有意ではなかった。同様の結果が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質で免疫したマウスでも観察された（図3B）。SARS-CoV-2スパイクタンパク質を免疫したマウス群では、IFN-γとTNF-αのレベルも上昇している（図3B）。今回の研究では、Pfizer-BioNTech社が開発したmRNAベースのワクチンを個体に投与し、その結果、SARS-CoV-2に対するスパイクタンパク質を有するエクソソームが、ワクチン初回投与後14日目までに誘導され、次いで、ブースター免疫後14日目までにスパイクタンパク質特異的Ab反応が発現したことが明らかになった。ワクチン接種4ヵ月後、血漿中のAbレベルは減少した。

この傾向は、スパイクタンパク質を持つ循環エクソソームについても観察された。これらの結果は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つ循環エクソソームの誘導が、mRNAベースのワクチン投与による効果的な免疫のために潜在的に必須であるという結論を支持するものである。我々は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を持つこれらのエクソソームがAPCに取り込まれ、免疫活性化をもたらすと仮定している。呼吸器ウイルス感染症におけるエクソソームの免疫原性の可能性は、すでに我々や他の研究者によって報告されている(11-13)。

また、ワクチン接種を受けた個体から分離したスパイクタンパク質を有する循環エクソソームをC57BL/6動物に免疫し、これらのエクソソームが免疫原性を有することを証明した。免疫後、これらの動物はSARS-CoV-2スパイク蛋白に対するAbsとSARS-CoV-2スパイク蛋白に特異的な細胞性免疫応答の両方を発現した。われわれの以前の研究で、肺の自己抗原を持つヒトエキソソームをマウスに免疫すると、肺の自己抗原に対するAbsが生じることが証明された。これはヒトエキソソームがマウスAPCに結合した後に起こり、マウスの免疫応答につながった。
したがって、マウスの免疫後に免疫応答が発現するメカニズムには、エクソソームとマウスAPCとの結合が必要であり、その結果、スパイク蛋白質に対する体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方が発現するのだと考えられる。
このような免疫戦略により、抗原刺激後にIFN-γとTNF-αを分泌する脾リンパ球の頻度が増加したことも興味深い。マウスモデルにおけるこれらの結果から、mRNAを用いた健康な個体へのワクチン接種は、Ab応答だけでなく細胞性免疫ももたらすと考えられる。結論として、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を持つエクソソームは、初回ワクチン接種後14日目に誘導され検出可能であり、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質に特異的なAbsは、ブースター投与後の後期に検出可能であった。我々は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質Agを持つ循環エクソソームの誘導が、健常人へのmRNAベースのワクチン接種後の効果的な免疫に必要であることを提唱する。また、ワクチン接種者のエクソソームには免疫原性があり、SARS-CoV-2スパイク蛋白質に対するAbsおよびスパイク蛋白質Agに対するT細胞応答を誘導することが示され、SARS-CoV-2スパイク蛋白質Agを含むmRNAベースのワクチン接種誘導エクソソームが体液性免疫だけでなく細胞性免疫応答も誘導することが示唆された。


以下省略



 


https://journals.aai.org/jimmunol/article/207/10/2405/234284/Cutting-Edge-Circulating-Exosomes-with-COVID-Spike?s=09







   











   





 






  






第一三共の資料「非臨床試験の概括評価」によれば、マウスの試験で全LNPのうちの13.3%が呼気から排出されたと記載されています。尿や糞を加えると22.9%が体外に排出されます。
mRNAやDNA断片はLNPに包まれていますから、これらが呼気中のLNPを介して第三者に伝播する可能性は十分にあるのではないでしょうか。
第一三共のLNPは独自のものでファイザーやモデルナのLNPとは異なりますが、それらの作用機序は同じですから、ファイザーやモデルナでも同様に呼気を介して体外に排出されている可能性は想像に難くない。
海外の研究者の方はこれをみて、世界で初めて呼気中のLNPを測定した結果ではないかとコメントされていました。

少なくとも呼気からLNPが排出される事は第一三共が認めています。
と言う事は、接種済みのマウスと未接種のマウスを同じケースに入れて2週間(168時間)以降に未接種のマウスからLNPやスパイクタンパク質を検出できるか試験すれば良いと言う事ですね。
この試験をなくしてシェディングはないとは言い切れませんし、言い切る理由もありません。


ワクチン接種者のエクソソームで免疫したマウスの脾臓リンパ球でサイトカイン（IFN-γとTNF-α）レベルが高い。






 




 







 







 











 





 






 







 






 







資料