ある日突然、進学校「椚ヶ丘中学校」の成績・素行不良者を集めた3年E組の元に防衛省の人間と、異形な姿をした謎の生物がやって来た。
マッハ20で空を飛び、月の7割を破壊して常時三日月の状態にしてしまった危険な生物は「来年3月までに自分を殺せなければ地球を破壊する」ことを宣言したうえ、「椚ヶ丘中学校3年E組」の担任教師となることを希望した。
意味の分からない要望に政府は戸惑いつつも、3年E組の生徒に「謎の生物の暗殺」を依頼。
生徒たちは最初こそ戸惑うが、「成功報酬:100億円」のために殺る気を出す。
その生物=殺せんせー（ころせんせー）の存在とその目的を把握しているのは日本をはじめ各国の首脳陣といったほんの一部の人間のみで、「殺せんせーの存在や殺せんせーの暗殺に携わっていることを、家族を含めた第三者へ絶対に口外してはならない。
口外した場合は“記憶消去処置”を施される」「殺せんせーは、3年E組の生徒に絶対に危害を加えてはいけない。
ただし、その家族友人は対象外」などの様々な決まりの下に生徒達は殺せんせーを様々な手段で暗殺しようと試みるが、毎回殺せんせーの素早さと予測不能の行動で阻止され、逆に殺せんせーによる手入れを受けることになってしまう。
しかし、いざ授業が始まってみると暗殺者と標的という異常な状況ながら、多くの生徒たちは殺せんせーの指導と手入れによってこの暗殺教室を楽しみ、今までの「学校中から差別された底辺学級」としてではない前向きな学校生活を送るようになっていく。
その一方、生徒の他にも殺せんせーを暗殺するため、世界中から暗殺者が送り込まれてくるのだった。
4月（第1話 - 第7話）
E組による殺せんせーの暗殺を狙いながらの学校生活が始まる。
誰もが有効的な攻撃ができない中、寺坂グループの圧迫的な提案で潮田渚は捨て身の暗殺を決行するが、殺せんせーの激怒を買い、生徒は契約により殺さないが生徒の家族は契約外であることを示され、「人に笑顔で胸を張れる暗殺」をするように諭される。
その後もE組に落とされたことにより野球部を退部させられた杉野友人を殺せんせーが論理的な事実を持って励ましたり教師不信の赤羽業の心身をケアするなど、生徒が教師を暗殺するという目的の中にもE組に落とされた理由を明らかにし、殺せんせーにしかできない方法で問題を解決または改善に向かわせるという指導はこれからも生徒一人一人に及んでいい効果を見せていく。
殺せんせーを監視する烏間惟臣は暗殺交じりの学校生活を異常と見なすものの、前向きになり明るい表情を見せる生徒たちの姿を見て、殺せんせーによる指導を認めるようになっていた。
しかし、進展を見せない生徒達の暗殺に不安を覚える国は、E組にプロの暗殺者を送り込むことを決断した。
5月（第8話 - 第22話）
殺せんせー暗殺のために、英語教師の名目で政府から派遣された殺し屋のイリーナ・イェラビッチが着任する。
生徒達はイリーナのビジネス的なやり方に不満を覚え学級崩壊を引き起こす事態となるが、イリーナ自身も烏間の説得で徐々に生徒達と打ち解け、クラスに溶け込んでいった。
その後椚ヶ丘中学校理事長・浅野學峯と対面した殺せんせーは彼の挑発まがいの発言から生徒達に試験勉強をさせるが、勉強よりも賞金100億を獲得することを重視する生徒達にあきれ、中間テストでクラス全員が学年50位以内に入らなければE組から出ていくと本気で宣言する。
テスト本番では理事長の妨害工作でE組の面々は50位内に入ることができなかったものの、上位に食い込んだカルマの挑発を受けた殺せんせーはE組残留を決める。
京都への修学旅行では、不良グループによる茅野・神崎の拉致事件、および国が雇った狙撃手・レッドアイによる暗殺作戦が起こるも、拉致は殺せんせーが事前に授けた策で無事解決し、暗殺もことごとく失敗に終わり滞りなく終了した。
修学旅行から戻ると、E組には最新技術を駆使して作られた自律思考固定砲台（律）が送り込まれていた。
当初は授業中でもお構いなしに暗殺を実行する彼女に生徒達は迷惑するが、殺せんせーに改造された律は一転生徒達と打ち解け、さらに自らの意志でE組の一員であることを選択する。
6月（第23話 - 第36話）
前原陽斗を侮辱し屈辱的な扱いをした土屋果穂と瀬尾智也に渚たちと殺せんせーが見事に仕返しをした数日後、イリーナの師匠にして殺し屋の斡旋業者・ロヴロが現れ、一向に暗殺できずにいる彼女にE組からの撤退を要求するが、殺せんせーのアイデアで烏間との模擬暗殺を行うことになる。
最終的に烏間の判断でイリーナの勝利となり、E組残留が決定した。
律に続き、第2の転校生暗殺者・堀部イトナが現れるが、彼は殺せんせーと自分は兄弟と発言してクラスを騒然とさせる。
イトナの保護者を名乗るシロの仲介のもと暗殺が始まるが、イトナは殺せんせーの物と同じ触手を出して殺せんせーを圧倒する。
しかし機転を利かせた殺せんせーが辛くも勝利しイトナは敗北により暴走しかけたものの、シロは休学すると言い残し、イトナを連れて去っていった。
その後、クラス対抗球技大会のエキシビションマッチの試合で杉野の旧友である進藤一考が率いる野球部と対戦することとなる。
周囲から負けを期待されながらもE組は殺せんせーの監督で野球部を圧倒、野球部の指揮権を理事長が乗っ取ったことで一時劣勢に立たされるものの殺せんせーとカルマの策略により野球部は敗北、殺せんせーは中間テストのリベンジを果たし杉野と進藤も無事に和解した。
7月（第37話 - 第56話）
防衛省から烏間の補任として鷹岡明が派遣されるが、鷹岡は過酷なカリキュラムを生徒達に課し、異を唱える生徒には容赦なく体罰を加える非情かつ冷酷な危険人物であった。
烏間は生徒達を救うために鷹岡の勝負の提案に乗り、渚を指名。最初は体格などで渚を侮っていた鷹岡だが、予想外の暗殺の才能により渚に敗北。
さらに理事長によって解雇通知を言い渡され、鷹岡はE組を去る。
鷹岡の一件から数日後、殺せんせーは裏山にE組専用のプールを設営するが、その中で殺せんせーの重大な弱点が「水」への接触であることが判明する。
殺せんせーは元水泳部の片岡メグの問題を解決したものの、その後シロに買収された寺坂竜馬の裏工作と再改造されたイトナによってプールで危機に陥ってしまう。
しかしカルマに叱責され策を授けられた寺坂により窮地を脱し、他の生徒達によって戦闘不能の状態になったイトナはシロと共に再び撤退していった。
期末テストが迫ると、殺せんせーは生徒達に総合点の他に1科目で学年1位を取った者には自身の触手を一本破壊する権利を与えると宣言する。
そして渚たちは理事長の息子・浅野学秀率いる学年屈指の秀才5人組「五英傑」の提案で、A組とE組のどちらが多くテストで学年一位を取るか賭けをすることになった。
勉強の末にE組は7人（理1人・社1人・英1人・家4人）が学年1位を取ることに成功し、E組は賭けの戦利品である沖縄の離島リゾートで行われる特別夏期講習への参加を獲得し、触手破壊を踏まえた暗殺をその島で行うこととなる。
8月（第57話 - 第76話）
リゾートでの殺せんせー暗殺の直前、ロヴロを講師に迎え最後の訓練が行われ、渚はロヴロに「必殺技」を伝授される。
普久間島での暗殺は順調に進むが、終盤で殺せんせーが奥の手中の奥の手「完全防御形態」となったことで暗殺は失敗に終わった。
さらに第三者勢力によって生徒の半数が未知のウイルスに感染させられてしまう（男子：岡島、杉野、前原、三村、村松、女子：神崎、倉橋、中村、原、狭間）。
未感染の生徒達（同じ未感染の奥田と竹林を除く）は黒幕を倒して治療薬を奪取すべく、裏社会と繋がりのある「普久間殿上ホテル」への侵入作戦を決行する。
潜入後はイリーナが警備員を引き付けるために一時離脱、烏間も黒幕が雇った殺し屋の毒ガスに倒れてしまうが、何とか黒幕の雇った3人の殺し屋（スモッグ・グリップ・ガストロ）を倒すことに成功する。
最上階にたどり着いた一同だったが、黒幕の正体はE組を逆恨みしていた鷹岡だったことが発覚。
さらに鷹岡は彼らの目の前でウイルスの治療薬を爆破し、怒りに燃える渚は彼と一騎討ちをすることになる。
当初は実戦経験が豊富な鷹岡に圧倒された渚だったが、ロヴロから授けられた「必殺技」で見事鷹岡を倒すことに成功する。
その後、生徒達に盛られたウイルスは殺し屋達の判断で食中毒菌を改良したタイプにすり替えられていたことが判明し、生徒達はホテルからの脱出に成功する。
夏休み最後の日は殺せんせーと生徒達は夏祭りを楽しむが、同時期にロヴロが死神に襲撃され、さらに南の島での暗殺の結果から殺せんせーの暗殺に成功した場合の賞金が300億円にアップされるなどE組の暗殺の環境が大きく変わり始めていた。
9月（第77話 - 第94話）
2学期が開始された矢先、竹林孝太郎が理事長の勧めで本校舎のA組に移籍していた事実が発覚する。
さらに自分達を見下すような発言をした竹林に腹を立てたE組は竹林に真相を確かめに行くが、今の自分には暗殺よりも家族に認められる方が大事だという彼の発言に大半の生徒は何も言えなくなってしまう。
そんな中、竹林は理事長から創立記念集会でE組を侮辱する内容のスピーチとE組管理委員会の設立をするように依頼される。
一度は引き受けるが、帰宅中に殺せんせーに諭されたことで自らの本心を全校生徒の前で打ち明け、理事長室から持ち出した盾を自ら破壊しE組に戻る。
暗殺訓練にフリーランニングが取り入れられてから数日後、殺せんせーを連想させる人物による連続下着泥棒事件が発生する。
調査に乗り出した渚たちと殺せんせーは、真犯人のシロとイトナに遭遇する。
当初はイトナの攻撃に押されていた殺せんせーだったが、彼の攻撃を見切り「完全防御形態」の応用技で撃退に成功する。
しかし度重なる敗北のショックやシロから見捨てられたことで触手が拒絶反応を起こしたイトナは暴走状態となり姿を消してしまう。
翌日、町中の携帯ショップを破壊していたイトナを発見したE組と殺せんせーは説得を試みるも、シロがイトナを連れ去り、後を追った殺せんせーもシロの罠の前に防戦一方となってしまう。
しかし、シロによって駒にされたことに怒った生徒たちによってイトナは奪還されてシロは撤退する。
そして寺坂グループの尽力によってイトナはE組に心を開き、触手を除去することに成功した後E組に迎え入れられる。
殺せんせーが木村正義の問題（名前のコンプレックス）を解決した数日後、磯貝悠馬がアルバイトをしていたことが五英傑に知られてしまい、黙認してもらう条件として体育祭の棒倒しでA組と勝負をすることになる。
A組は助っ人として外国人4人を研修留学生として投入してきたが、磯貝は殺せんせーの個別授業をヒントにした作戦を展開してこれを撃破し、E組は勝利する。
10月（第95話 - 第110話）
体育祭から数日後、迫る暗殺期限に焦りを感じた生徒達は岡島大河の提案で暗殺技能向上のため街中でフリーランニングを行うが、岡島が誤って無関係の老人、松方にケガをさせてしまう。
これに激怒した殺せんせーは生徒に初となる体罰（触手によるビンタ）を決行し、反省の意味も含めて中間試験までの2週間を「テストよりも優先する勉強をする」としてテスト勉強を禁止し、松方が経営する保育施設を生徒達で手伝うことを提案する。
2週間の手伝いを無事に終えるも中間試験ではE組全員が大幅に順位を下げる結果となるが、唯一上位に食い込んだカルマに触発されて生徒達は自分達の力は誰かのために使うと決意し、烏間から新たな体育着を譲り受ける。
レッドアイが死神に襲撃された数日後、烏間の些細な発言が原因でイリーナが行方不明になる事件が発生。
その直後死神がE組の前に現れ、イリーナを人質に取っていることを話して生徒達だけで自身の下へ来ることを要求する。
殺せんせーと烏間を欠いた状態で生徒たちは超体育着を着て死神のアジトに乗り込むも罠にかかり捕えられてしまう。
一度は脱出に成功するも死神の高度な技術やイリーナの裏切りにより再び捕えられ、さらに救出に来た殺せんせーも捕えられてしまう。
しかし死神が生徒ごと暗殺を遂行しようとしていることを知った烏間は死神を止めるべく反撃を開始。
烏間の驚異的な実力を目の当たりにした生徒たちは殺せんせーと共に死神に一泡吹かせるために行動を開始し、見事騙すことに成功。
烏間は死神と直接対決に臨み、殺せんせーの策で見事勝利した後、死神に唆されていたイリーナとも和解する。
この一件を受けて、殺せんせーは防衛省に「暗殺によって生徒を巻き添えにすれば賞金は支払われないものとする」との条件を突きつけるも、既に各国共同で最終暗殺計画の準備が着々と進められていた。
11月（第111話 - 第118話）
殺せんせー暗殺期限が迫る中、E組で進路相談が行われる。そこで渚は自分は殺し屋になるべきなのかを殺せんせーに打ち明ける。
殺せんせーは自分自身をもう一度見つめなおすように勧めるも、渚は母親である広海からの進路や生き方の強制に苦しめられていた。
渚を本校舎へ復帰させようとする広海がそのことを相談するべくE組を訪れる。
出張中の烏間に変わり、彼に扮した殺せんせーが面談に臨むも、広海の本性を知りその申し出を拒否する。
それに逆上した広海は渚にE組の校舎を燃やさせようとするが、渚が自らの思いを語った上で殺せんせーを暗殺しに来た殺し屋を撃退する様子を見て、息子が自身と別の存在であることを痛感し、紆余曲折の末E組に残ることを認める。
その数日後学園祭が行われることとなり、大手外食チェーンとスポンサー契約を結んだA組に対抗するべく、E組は山で採れた様々な食材を使用した飲食店を開くことに決定する。
文化祭では当初は学秀が芸人やアイドルを呼んだ影響でA組がリードしていたが、以前普久間島で女装した渚に惚れた金持ちのユウジがE組の情報を自身のグルメブログに書き込んだことで2日目には大盛況となる。
結果的に自然の生態系が乱れることを懸念した殺せんせーの判断で途中で店を畳むが、それでも全校で3位の売り上げをたたき出した。
理事長は学秀が努力を怠ったと批判するが、学秀は弱い相手に勝ったところで強者になれないという結論に辿りついたと理事長に告げる。
理事長は学秀以外の五英傑にE組に対する憎悪を植え付け、期末テストは自身が取り仕切ると宣言する。
12月（第119話 - 第141話）
期末試験が近づく中、理事長がA組の担任となるも、E組への憎悪を煽る異様な教育風景に危機感を感じた学秀はE組に「期末テストで学年上位を独占することで理事長の教育方針を壊してほしい」と依頼する。
そしてテスト本番では多くの生徒が難易度の上がったテストに苦戦するが、E組の生徒たちは全員が学年50位以内に入ることに成功する。
一方でA組の生徒たちに自身の教育方針を真っ向から否定された理事長は思考が暴走し、E組の校舎を半壊させ、殺せんせーに解雇通知を突き付け、互いの命を懸けた勝負を挑んでくる。
勝負では当初こそ理事長がリードするも、殺せんせーからE組制度を通して本当に自分がやりたかったこと・成し遂げたかったことを指摘された理事長の心境は変化し、E組の存続を認める。
しかし、冬休み直前、茅野が触手を出して殺せんせーを襲撃する事件が発生。
彼女は自分がE組の元担任・雪村あぐりの妹・雪村あかりで姉の復讐のために今まで行動していたことを語り、殺せんせーに対決を要求する。
対決では茅野は触手を発火させて殺せんせーを追い詰めるも、渚の秘策の前に我を取り戻す。
そして殺せんせーは3月には自分は死ぬこと、そして自分はかつて「死神」と呼ばれていた殺し屋であることを明かし、自分の過去を語り始める。
かつて「死神」として活動していた殺せんせーは、とある仕事で唯一の弟子（E組が出会った死神）に裏切られたことで、天才科学者・柳沢誇太郎が主任を務める研究所にモルモットとして捕らわれてしまった。
そこで柳沢の「人体で反物質を生成する」研究の実験体として実験の日々を送ることになる。
そんな中E組の前担任である雪村あぐりと出会う。当初は実験とあぐりを利用して脱走を計画していた死神だったが、あぐりと接するうちに心境に変化が生じ、徐々に彼女と心を通わせていく。
しかし実験の影響で死神の手足は変化して触手と呼ばれるようになる。
3月になると月で同じ実験をしていたマウスが月ごと爆発したことで実験の欠陥が明らかになり、柳沢は殺せんせーを始末しようと行動を開始する。
当の殺せんせーはこれを期に反物質の力を開放して脱走を図る。
その圧倒的なスキルと触手に警備員がなすすべなく倒されていく中、彼を止めようとしたあぐりが触手地雷に貫かれて致命傷を負ってしまう。
自分の力を後悔した死神は、彼女の最後の言葉を実行するために自ら弱くなることを望み、現在の姿となったのであった。
これらの告白を機に、E組の皆は、全ての真相にたどり着き、自分たちの担任教師を実際に暗殺する任務を背負っているという事実に直面してしまう。
その結果、冬休み間はE組からの暗殺を誰一人として実行できなかった。
1月（第142話 - 第153話）
冬休みに誰一人暗殺を実行できないまま、遂に3学期を迎えたものの、E組の雰囲気はいつになく気まずくなっていた。
殺せんせーの正体を知ったことで自らの殺し屋としての過去を内省したイリーナは、担任を殺しあぐねている生徒たちに、きちんと自分の気持ちと向き合うように諭す。
そこで、殺せんせーを殺したくないという気持ちを固めた渚や一部のE組生徒は、彼の生命を救い出す方法を考え始めるが、中村など一部の生徒が渚たちの考えに真っ向から反対する考えを示す。
渚は何とか説得を試みるも、暗殺を続けたい一人であるカルマとE組以前の擦れ違いも重なり口論の末暴行沙汰に陥りかける。
そこをことの張本人である殺せんせーが殺す派と殺さない派のサバゲーで決着を付けることを提案し、提案に乗ったE組は両陣営互いのスキルを生かし壮絶な消耗戦を展開する。
最後は渚とカルマの一騎討ちの末渚たち殺さない派が勝利し、1月の間は殺せんせーを助ける方法を模索することに決定する。
律の調査によりISSで反物質に関する研究が行われていることを知ったE組一同は、そのデータを知るべく殺せんせー発案の潜入ミッションを実行する。
ロケットにダミーの人形にすり替わる形で乗り、ISSに潜入した渚とカルマは宇宙飛行士達と親睦を深めてデータの入手に成功。
帰還後に解析を行った結果、殺せんせーが地球ごと爆発する可能性は1%以下と判明する。
しかし教師として生徒たちの願いを一時は聞き入れていた烏間は、殺せんせーが危険生物であることと防衛省の考え上暗殺依頼が撤回される可能性は低いと告げる。
これを機に渚たちは暗殺への考えを改め、もう一度正面から暗殺の任務と向き合った末に、E組全員で卒業までは任務を続けることを誓うのだった。
2月（第154話 - 第163話）
本格的に受験シーズンが始まり、竹林が第一志望校に不合格するも殺せんせーの助言とE組での経験から立ち直り、渚は補欠合格となるも将来の目標を明確にし始める。
バレンタインでクラスの男女の仲が深まりつつある中、柳沢と二代目「死神」が殺せんせー暗殺に向けて動きだし、超国家間でも大規模な最終暗殺計画が着々と進められるなど世界が殺せんせー暗殺に向けて動き出していた。
E組が政府に雇われたホウジョウと接触した後、行方不明となっていたイトナの父が現れ、生徒全員の進路が決まりつつあった。
3月（第164話 - 第178話）
E組全員が第二志望内で高校に合格し、E組専用の卒業アルバムが殺せんせーにより撮影される。
撮影後の夜、遂に各国家間による最終暗殺計画が始動する。暗殺兵器「天の矛」「地の盾」により殺せんせーは完全に旧校舎に閉じ込められ、世間に暗殺と殺せんせーのことが事実と異なる形で報道される事態が発生。
学校へ向かおうとした生徒達は軍とマスコミに取り囲まれる事態に陥り、辛くも逃げ延びるも情報を集めようとした行動を危険視した政府によって捕えられてしまう。
生徒達は暗殺作戦中止を懇願するも、殺せんせーの人間だった頃の所業や地球爆発の危険が0%でないことを考慮すれば容認できないと跳ね除けられてしまい、暗殺終了まで監視下に置かれ軟禁状態に置かれることに。
生徒達は烏間の言葉と情報を受け冷静さを取り戻し、自分達に出来ることを考えることにし殺せんせーに会うための作戦を立てる。
そして天の矛発射当日、イリーナの協力で脱出に成功した生徒達は警備の目を掻い潜り裏山に侵入、ホウジョウ率いる傭兵部隊「群狼」を撃破し、さらなる連携でホウジョウを戦闘不能に陥らせ見事殺せんせーの下へ辿り着くことに成功する。
生徒達は殺せんせーに何とかして逃げようと提案するも、殺せんせーは自分の危険性や世界中の英知を結集した今回の作戦は完璧であったと納得のいかない生徒達を諭した。
そして中村が持ってきていた殺せんせーのバースデーケーキを囲み束の間の平穏が訪れたが、柳沢と触手生物化した二代目「死神」が現れ、そのまま戦闘に突入。
殺せんせー以上の能力を発揮する二代目と自らの体内に触手を埋め込んだ柳沢の猛攻に劣勢に立たされる殺せんせーだったが、二代目の攻撃から殺せんせーを庇った茅野が胸を貫かれて絶命してしまう。
殺せんせーは全ての感情を込めたエネルギー砲で二代目を攻撃し因縁に決着をつけた後、1年間磨き続けた力を使い茅野を蘇生させる。
全てが片付いた後、E組はレーザーが発射されることを知った上であえて自分達の手で殺せんせーを殺すことを決意する。
一同の同意の元、渚が殺せんせーに止めを刺し、涙ながらにE組は暗殺教室を卒業した。
卒業式を終えた後、余波でE組制度は廃止となり理事長は学園の経営を手放すこととなる。
E組は支払われた賞金を学費と将来の頭金、わかばパークなどへの寄付、「とある物」の購入に使い、残りの賞金は政府へと返還する。
一年の象徴であった三日月は徐々に崩壊を始め、元の球形へ戻ろうとしていた。
7年後（第178話 - 第180話（最終回））
生徒達はそれぞれの道を歩みつつも、賞金で買い取った「とある物」である裏山の旧校舎に度々集い「手入れ」を行っていた。
高校で不良たちを相手に、E組での経験を活かし授業を始める教育実習生となった渚の姿で物語は幕を閉じる。