FIG 1 Agarose gel electrophoresis of the TRS-1 (lanes 1 to 4) and TRS-2 (lanes 5 to 8) regions from terbinafine-resistant T. rubrum clinical isolates with the same point mutation in the SQLE gene.
SQLE遺伝子に同じ点突然変異をもつ、
テルビナフィン耐性紅色白癬菌臨床分離株の
TRS-1(レーン1から4)とTRS-2(レーン5から8)領域のアガロースゲル電気泳動
(A) Strains with the replacement of Leu393 with Phe in SQLE.
SQLEに、393のロイシンがフェニルアラニンの置換がある株
Lanes 1 and 5, TIMM20083; レーン1と5
lanes 2 and 6, TIMM20084; レーン2と6
lanes 3 and 7, TIMM20093; レーン3と7
lanes 4 and 8, TIMM20094. レーン4と8
(B) Strains with the replacement of Phe397 with Leu in the SQLE.
SQLEにおける397のフェニルアラニンがロイシンの置換がある株
Lanes 1 and 5, TIMM20085; レーン1と5
lanes 2 and 6, TIMM20086; レーン2と6
lanes 3 and 7, TIMM20087; レーン3と7
lanes 4 and 8, TIMM20092. レーン4と8
Leu397 is encoded by TTA in TIMM20085 and TIMM20087 and by CTC in TIMM20086 and TIMM20092.
397のロイシンは、TIMM20085 株とTIMM20087株においては核酸塩基配列TTAによってエンコードされ、
TIMM20086 株とTIMM20092株では、核酸塩基配列CTCによってエンコードされる
･････････････
FIG 2
Introduction of point mutations into the endogenous SQLE gene of A. vanbreuseghemii by gene replacement strategy.
A.バンブレセゲミの内在性SQLE遺伝子へ遺伝子置換手順によって点突然変異の導入
(A) Schematic representation of a series of binary AvSQLE-targeting vectors.
バイナリーAvSQLEターゲッティングベクターの一連の概略図
DNA fragments (SQLEa and SQLEb) containing the 5= UTR of the AvSQLE gene and the open reading frames encoding wild-type and mutated A. vanbreuseghemii or T. rubrum SQLE proteins (ORF*) as well as the 3= UTR of the AvSQLE gene were
subcloned into the pAg1-AbKu70/T2 upstream (SpeI/ApaI) and down- stream (BamHI/KpnI) of the PcFLP/FRT module, respectively (Table 2 and Fig. S1).
AvSQLE遺伝子の3'末端非翻訳領域と同様に
AvSQLE遺伝子の5'末端非翻訳領域と
野生型と突然変異A.バンブレセゲミまたは紅色白癬菌SQLE蛋白質をエンコードするオープンリーディングフレームを含むDNAフラグメント(SQLEa とSQLEb)を、各々、
PcFLP/FRT モジュールの、pAg1-AbKu70/T2上流(SpeI/ApaI)と下流(BamHI/Kpn)に
サブクローニングした
(Table2とFigS1)
The nptII cassette is composed of Aspergillus nidulans trpC promoter (PtrpC), E. coli neomycin phosphotransferase gene (nptII), and the A. fumigatus cgrA terminator (TcgrA).
nptII(ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子)カセットは、アスペルギルスニデュランス trpCプロモーター(PtrpC),
大腸菌ネオマイシン リン酸転移酵素遺伝子(nptII)と、A.フミガツスcgr A転写終結コドン(ターミネータ)(TcgrA)で構成される
Pctr4, T. rubrum ctr4 promoter (34);
紅色白癬菌ctr4プロモーター
Pcflp, the synthetic flp gene with Penicillium chrysogenum-optimized codon usage (35);
ペニシリウムクリソゲナム最適化コドン使用の合成flp 遺伝子
FLP: flippase 組換え酵素
FRT: flpの標的配列（FLP recogition target）
flpとfrtを利用し
部位特異的な体細胞組換え技術で、効率的な遺伝的モザイククローンが作製
Ttrp1, Cryptococcus neoformans trp1 terminator (36);
クリプトコッカスネオフォルマンスtrp1ターミネータ(転写終結コドン);
FRT, FLP recombinase target sequence;
FLPリコンビナーゼ標的塩基配列;
LB and RB, left and right borders, respectively;
各々、左と右の境界
A, ApaI; (酢酸菌由来、制限酵素(DNAの特異的塩基配列を認識して切断するエンドヌクレアーゼ
B, BamHI;
C, ClaI;
K, KpnI;
Sc, SacI;
Sh, SphI;
Sp, SpeI.
(B) Schematic representation of the AvSQLE locus before and after homologous recombination and excision of the PcFLP/FRT module.
相同的組換えとPcFLP/FRTモジュールの切除の前と後のAvSQLE遺伝子座の概略図
Site-specific recombination between the flanking FRT sequences was induced by
conditional expression of Pcflp after transformation.
形質転換後、Pcflpの条件付き発現によって、隣接するFRT配列の間の
部位特異的組換えが誘発された
All the internal BamHI sites contained in the amplified fragments were inactivated by overlap extension PCR.
増幅フラグメントに含まれた内部BamHは全てオーバーラップエクステンションPCRによって
不活性化された
(C) Southern blotting. サザンブロッティング
Aliquots of approximately 10 μg of total DNA from each mutant strain were digested with BamHI and separated by electrophoresis on 0.8% (wt/vol) agarose gels.
各変異株から全DNAのうち約10μgの一定分割量が、BamHIで消化され、
0.8% (wt/vol) アガロースゲル上の電気泳動によって、分離された
1062Av1401 indicates the parent strain.
1062Av1401は親株を指す
Lane 1, Av-FRT-1-3 (AvSQLE’s control);
lane 2, Av-S38A (Leu393Phe);
lane 3, Av-1-3 (Leu393Ser);
lane 4, Av-S714J6 (Phe397Leu);
lane 5, Av-7-5 (Phe397Ile);
lane 6, Av-4-1 (Phe397Val);
lane 7, Av-S28M (Phe415Val);
lane 8, Av-2-4 (His440Tyr);
lane 9, Tr-FRT-52-9 (TrSQLE’s control);
lane 10, Tr-T31C (Leu393Phe);
lane 11, Tr-2-3 (Leu393Ser);
lane 12, Tr-T719J (Phe397Leu);
lane 13, Tr-4-1 (Phe397Ile);
lane 14, Tr-75-6 (Phe397Val);
lane 15, Tr-T4B (Phe415Val);
lane 16, Tr-2-1 (His440Tyr).
A 566-bp fragment of the AvSQLE gene was amplified by PCR with the primer pair
AvSQLE-F23 and AvSQLE-R21 (Table 4) and used as a hybridization probe.
AvSQLE遺伝子の566-bpフラグメントは
プライマー対AvSQLE-F23 とAvSQLE-R21(Table4)
のPCRで増幅され、
ハイブリダイゼーションプローブ(分子交雑プローブ)
として用いられた
DNA standard fragment sizes are shown on the left
DNAスタンダードフラグメントサイズは左に示す
･････････････････
FIG 3
The growth properties of A. vanbreuseghemii transformants expressing mutated AvSQLE and TrSQLE proteins on solid terbinafine-containing medium.
固体テルビナフィン含有培地での
変異AvSQLEとTrSQLE蛋白質を発現している
A.バンブレセゲミ形質転換体の増殖の特性
Aliquots of 10μL of conidial suspensions containing 1 × 105cells were spotted onto SDA with (+) or without(-) 0.005 μg/ml terbinafine and incubated at 28°C for 3 days.
1 × 105細胞を含んだ懸濁液の
10μLの一定分量が、0.005μg/mLテルビナフィンを
含む(+)または含まない(-)サブローデキストロース寒天培地上へ点状に置かれ28℃3日間培養された
Bar, 1.0 cm. 横棒は1.0cm
･････････････････
FIG 4
The growth properties of A. vanbreuseghemii transformants with the substitution Phe397Val in the SQLE protein (A)
and T. rubrum clinical isolates harboring the Phe397Val or Phe415Ser substitution in the SQLE protein
(TIMM20097 or TIMM20098, respectively) in comparison to a Leu or Val residue, respectively
(TIMM20085 and TIMM20082, respectively) (B)
on solid medium.
固体培地上で、
SQLE蛋白質において397のフェニルアラニンがバリン
の置換をもつ、A.バンブレセゲミ形質転換体の増殖の
特性(A)と
SQLE蛋白質に
397のフェニルアラニンがバリンまたは
415のフェニルアラニンがセリンの置換を内在する
紅色白癬菌臨床分離株(各々TIMM20097 またはTIMM20098)の
(ロイシンまたはバリン残基,各々TIMM20085 とTIMM20082と比較した)増殖の特性
Aliquots of 10μ l of conidial suspensions containing 1 ×105cells were spotted onto SDA and incubated at 28°C for 4 days (A) or 5 days (B).
1 ×105細胞を含む懸濁液の
10μLの一定分割量をサブローデキストロース寒天培地へ点状に置き、28℃4日間(A)または5日間(B)培養した
The wild-type T. rubrum CBS118892 was used as control.
野生型紅色白癬菌CBS118892が対照として用いられた
Bar, 1.0 cm. 横棒は1.0cm
･････････････････
TABLE 1
Phenotypic and genotypic characteristics of the clinical isolates obtained from patients with dermatophyte infections.
皮膚糸状菌感染症の患者から得られた
臨床分離株の表現型と遺伝子型の特徴
aAll the clinical isolates were obtained in Switzerland and deposited in the culture collection of Teikyo University Institute of Medical Mycology (TIMM).
臨床分離株は全てスイスで得られ、
帝京大学医真菌研究センター(TIMM)菌株コレクション
へ預けられた
bThe growth ability of the clinical isolates on SDA containing 0.2 μg/ml terbinafine is indicated as weak (+) to vigorous(+++)
0.2 μg/mlテルビナフィンを含むサブローデキストロース寒天培地における臨床分離株の増殖能は
弱い(+)または活発(+++)として示す
cND, not determined. 未定
dResults represent expression levels from three independent real-time PCR experiments.
結果は、3回の独立したリアルタイムPCR実験からの発現レベルを表す
Expression levels of SQLE genes were indicated as relative fold changes
compared to the CT mean of the wild-type strain CBS118892 data.
SQLE遺伝子の発現レベルは
野生型株CBS118892データのCt値の平均値と比較した、相対的倍率変化として示した
･････････････
TABLE 2 Plasmids used in this study.
この研究で用いたプラスミド
aORF, open reading frame; オープンリーディングフレーム
sSQLE, synthetic SQLE. 合成SQLE
･････････････
TABLE 3 Susceptibilities to terbinafine and itraconazole of A. vanbreuseghemii transformants expressing mutated forms of the SQLE gene and corresponding expression levels.
SQLE遺伝子の変異型を発現するA.バンブレセゲミ形質転換体の
テルビナフィンとイトラコナゾールの感受性と対応する発現レベル
aResults are from three independent real-time PCR experiments.
結果は3回の独立するリアルタイムPCR実験から
ND, not determined. 未定
Expression levels of SQLE genes are indicated as relative fold changes compared to the CT mean of the parent strain 1062Av1401 data.
SQLE遺伝子の発現レベルは
親株1062Av1401データの平均Ct値と比較した相対的倍率変化で示す
･････････････
TABLE 4 PCR primers used in this study
この研究で用いたPCRプライマー
aIntroduction of nucleotide substitutions into SQLE genes by overlap extension PCR.
オーバーラップエクステンションPCRによるSQLE遺伝子へのヌクレオチド置換の導入
bRestriction sites are underlined, and substitutions are in boldface.
制限酵素部位は下線、置換は太字
SQLE遺伝子に同じ点突然変異をもつ、
テルビナフィン耐性紅色白癬菌臨床分離株の
TRS-1(レーン1から4)とTRS-2(レーン5から8)領域のアガロースゲル電気泳動
(A) Strains with the replacement of Leu393 with Phe in SQLE.
SQLEに、393のロイシンがフェニルアラニンの置換がある株
Lanes 1 and 5, TIMM20083; レーン1と5
lanes 2 and 6, TIMM20084; レーン2と6
lanes 3 and 7, TIMM20093; レーン3と7
lanes 4 and 8, TIMM20094. レーン4と8
(B) Strains with the replacement of Phe397 with Leu in the SQLE.
SQLEにおける397のフェニルアラニンがロイシンの置換がある株
Lanes 1 and 5, TIMM20085; レーン1と5
lanes 2 and 6, TIMM20086; レーン2と6
lanes 3 and 7, TIMM20087; レーン3と7
lanes 4 and 8, TIMM20092. レーン4と8
Leu397 is encoded by TTA in TIMM20085 and TIMM20087 and by CTC in TIMM20086 and TIMM20092.
397のロイシンは、TIMM20085 株とTIMM20087株においては核酸塩基配列TTAによってエンコードされ、
TIMM20086 株とTIMM20092株では、核酸塩基配列CTCによってエンコードされる
･････････････
FIG 2
Introduction of point mutations into the endogenous SQLE gene of A. vanbreuseghemii by gene replacement strategy.
A.バンブレセゲミの内在性SQLE遺伝子へ遺伝子置換手順によって点突然変異の導入
(A) Schematic representation of a series of binary AvSQLE-targeting vectors.
バイナリーAvSQLEターゲッティングベクターの一連の概略図
DNA fragments (SQLEa and SQLEb) containing the 5= UTR of the AvSQLE gene and the open reading frames encoding wild-type and mutated A. vanbreuseghemii or T. rubrum SQLE proteins (ORF*) as well as the 3= UTR of the AvSQLE gene were
subcloned into the pAg1-AbKu70/T2 upstream (SpeI/ApaI) and down- stream (BamHI/KpnI) of the PcFLP/FRT module, respectively (Table 2 and Fig. S1).
AvSQLE遺伝子の3'末端非翻訳領域と同様に
AvSQLE遺伝子の5'末端非翻訳領域と
野生型と突然変異A.バンブレセゲミまたは紅色白癬菌SQLE蛋白質をエンコードするオープンリーディングフレームを含むDNAフラグメント(SQLEa とSQLEb)を、各々、
PcFLP/FRT モジュールの、pAg1-AbKu70/T2上流(SpeI/ApaI)と下流(BamHI/Kpn)に
サブクローニングした
(Table2とFigS1)
The nptII cassette is composed of Aspergillus nidulans trpC promoter (PtrpC), E. coli neomycin phosphotransferase gene (nptII), and the A. fumigatus cgrA terminator (TcgrA).
nptII(ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子)カセットは、アスペルギルスニデュランス trpCプロモーター(PtrpC),
大腸菌ネオマイシン リン酸転移酵素遺伝子(nptII)と、A.フミガツスcgr A転写終結コドン(ターミネータ)(TcgrA)で構成される
Pctr4, T. rubrum ctr4 promoter (34);
紅色白癬菌ctr4プロモーター
Pcflp, the synthetic flp gene with Penicillium chrysogenum-optimized codon usage (35);
ペニシリウムクリソゲナム最適化コドン使用の合成flp 遺伝子
FLP: flippase 組換え酵素
FRT: flpの標的配列（FLP recogition target）
flpとfrtを利用し
部位特異的な体細胞組換え技術で、効率的な遺伝的モザイククローンが作製
Ttrp1, Cryptococcus neoformans trp1 terminator (36);
クリプトコッカスネオフォルマンスtrp1ターミネータ(転写終結コドン);
FRT, FLP recombinase target sequence;
FLPリコンビナーゼ標的塩基配列;
LB and RB, left and right borders, respectively;
各々、左と右の境界
A, ApaI; (酢酸菌由来、制限酵素(DNAの特異的塩基配列を認識して切断するエンドヌクレアーゼ
B, BamHI;
C, ClaI;
K, KpnI;
Sc, SacI;
Sh, SphI;
Sp, SpeI.
(B) Schematic representation of the AvSQLE locus before and after homologous recombination and excision of the PcFLP/FRT module.
相同的組換えとPcFLP/FRTモジュールの切除の前と後のAvSQLE遺伝子座の概略図
Site-specific recombination between the flanking FRT sequences was induced by
conditional expression of Pcflp after transformation.
形質転換後、Pcflpの条件付き発現によって、隣接するFRT配列の間の
部位特異的組換えが誘発された
All the internal BamHI sites contained in the amplified fragments were inactivated by overlap extension PCR.
増幅フラグメントに含まれた内部BamHは全てオーバーラップエクステンションPCRによって
不活性化された
(C) Southern blotting. サザンブロッティング
Aliquots of approximately 10 μg of total DNA from each mutant strain were digested with BamHI and separated by electrophoresis on 0.8% (wt/vol) agarose gels.
各変異株から全DNAのうち約10μgの一定分割量が、BamHIで消化され、
0.8% (wt/vol) アガロースゲル上の電気泳動によって、分離された
1062Av1401 indicates the parent strain.
1062Av1401は親株を指す
Lane 1, Av-FRT-1-3 (AvSQLE’s control);
lane 2, Av-S38A (Leu393Phe);
lane 3, Av-1-3 (Leu393Ser);
lane 4, Av-S714J6 (Phe397Leu);
lane 5, Av-7-5 (Phe397Ile);
lane 6, Av-4-1 (Phe397Val);
lane 7, Av-S28M (Phe415Val);
lane 8, Av-2-4 (His440Tyr);
lane 9, Tr-FRT-52-9 (TrSQLE’s control);
lane 10, Tr-T31C (Leu393Phe);
lane 11, Tr-2-3 (Leu393Ser);
lane 12, Tr-T719J (Phe397Leu);
lane 13, Tr-4-1 (Phe397Ile);
lane 14, Tr-75-6 (Phe397Val);
lane 15, Tr-T4B (Phe415Val);
lane 16, Tr-2-1 (His440Tyr).
A 566-bp fragment of the AvSQLE gene was amplified by PCR with the primer pair
AvSQLE-F23 and AvSQLE-R21 (Table 4) and used as a hybridization probe.
AvSQLE遺伝子の566-bpフラグメントは
プライマー対AvSQLE-F23 とAvSQLE-R21(Table4)
のPCRで増幅され、
ハイブリダイゼーションプローブ(分子交雑プローブ)
として用いられた
DNA standard fragment sizes are shown on the left
DNAスタンダードフラグメントサイズは左に示す
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FIG 3
The growth properties of A. vanbreuseghemii transformants expressing mutated AvSQLE and TrSQLE proteins on solid terbinafine-containing medium.
固体テルビナフィン含有培地での
変異AvSQLEとTrSQLE蛋白質を発現している
A.バンブレセゲミ形質転換体の増殖の特性
Aliquots of 10μL of conidial suspensions containing 1 × 105cells were spotted onto SDA with (+) or without(-) 0.005 μg/ml terbinafine and incubated at 28°C for 3 days.
1 × 105細胞を含んだ懸濁液の
10μLの一定分量が、0.005μg/mLテルビナフィンを
含む(+)または含まない(-)サブローデキストロース寒天培地上へ点状に置かれ28℃3日間培養された
Bar, 1.0 cm. 横棒は1.0cm
･････････････････
FIG 4
The growth properties of A. vanbreuseghemii transformants with the substitution Phe397Val in the SQLE protein (A)
and T. rubrum clinical isolates harboring the Phe397Val or Phe415Ser substitution in the SQLE protein
(TIMM20097 or TIMM20098, respectively) in comparison to a Leu or Val residue, respectively
(TIMM20085 and TIMM20082, respectively) (B)
on solid medium.
固体培地上で、
SQLE蛋白質において397のフェニルアラニンがバリン
の置換をもつ、A.バンブレセゲミ形質転換体の増殖の
特性(A)と
SQLE蛋白質に
397のフェニルアラニンがバリンまたは
415のフェニルアラニンがセリンの置換を内在する
紅色白癬菌臨床分離株(各々TIMM20097 またはTIMM20098)の
(ロイシンまたはバリン残基,各々TIMM20085 とTIMM20082と比較した)増殖の特性
Aliquots of 10μ l of conidial suspensions containing 1 ×105cells were spotted onto SDA and incubated at 28°C for 4 days (A) or 5 days (B).
1 ×105細胞を含む懸濁液の
10μLの一定分割量をサブローデキストロース寒天培地へ点状に置き、28℃4日間(A)または5日間(B)培養した
The wild-type T. rubrum CBS118892 was used as control.
野生型紅色白癬菌CBS118892が対照として用いられた
Bar, 1.0 cm. 横棒は1.0cm
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TABLE 1
Phenotypic and genotypic characteristics of the clinical isolates obtained from patients with dermatophyte infections.
皮膚糸状菌感染症の患者から得られた
臨床分離株の表現型と遺伝子型の特徴
aAll the clinical isolates were obtained in Switzerland and deposited in the culture collection of Teikyo University Institute of Medical Mycology (TIMM).
臨床分離株は全てスイスで得られ、
帝京大学医真菌研究センター(TIMM)菌株コレクション
へ預けられた
bThe growth ability of the clinical isolates on SDA containing 0.2 μg/ml terbinafine is indicated as weak (+) to vigorous(+++)
0.2 μg/mlテルビナフィンを含むサブローデキストロース寒天培地における臨床分離株の増殖能は
弱い(+)または活発(+++)として示す
cND, not determined. 未定
dResults represent expression levels from three independent real-time PCR experiments.
結果は、3回の独立したリアルタイムPCR実験からの発現レベルを表す
Expression levels of SQLE genes were indicated as relative fold changes
compared to the CT mean of the wild-type strain CBS118892 data.
SQLE遺伝子の発現レベルは
野生型株CBS118892データのCt値の平均値と比較した、相対的倍率変化として示した
･････････････
TABLE 2 Plasmids used in this study.
この研究で用いたプラスミド
aORF, open reading frame; オープンリーディングフレーム
sSQLE, synthetic SQLE. 合成SQLE
･････････････
TABLE 3 Susceptibilities to terbinafine and itraconazole of A. vanbreuseghemii transformants expressing mutated forms of the SQLE gene and corresponding expression levels.
SQLE遺伝子の変異型を発現するA.バンブレセゲミ形質転換体の
テルビナフィンとイトラコナゾールの感受性と対応する発現レベル
aResults are from three independent real-time PCR experiments.
結果は3回の独立するリアルタイムPCR実験から
ND, not determined. 未定
Expression levels of SQLE genes are indicated as relative fold changes compared to the CT mean of the parent strain 1062Av1401 data.
SQLE遺伝子の発現レベルは
親株1062Av1401データの平均Ct値と比較した相対的倍率変化で示す
･････････････
TABLE 4 PCR primers used in this study
この研究で用いたPCRプライマー
aIntroduction of nucleotide substitutions into SQLE genes by overlap extension PCR.
オーバーラップエクステンションPCRによるSQLE遺伝子へのヌクレオチド置換の導入
bRestriction sites are underlined, and substitutions are in boldface.
制限酵素部位は下線、置換は太字