After 3 days, the growing mycelia from each strain were collected, frozen, and ground under liquid nitrogen with a Multi-Beads shocker (Yasui Kikai) at 1,800 rpm for 10 s, which was repeated 3 times.
3日後、各株から増殖菌糸は採取され、凍結され、
マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1,800rpmで10秒間、液体窒素下で粉砕され、それを3回繰り返した
Total RNA was extracted using an RNeasy Plant minikit (Qiagen) and was treated with DNase I (Invitrogen).
全RNAが、RNeasy Plant minikit(キアゲン)を使い抽出され、
DNase I (インビトロジェン)で治療された
First-strand cDNA was synthesized using a
high-capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems).
cDNAの第一鎖(First-strand)が
high-capacity RNA-to-cDNA kit
(アプライドバイオシステムズ)を用いて合成された
The quantitative real-time reverse transcription-PCR (qRT-PCR) analysis was performed using Fast SYBR green PCR master mix on
an ABI PRISM 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems) under standard conditions, according to the manufacturer’s recommendations.
定量的リアルタイム逆転写PCR(qRT-PCR)解析は、
メーカー推奨事項に沿った標準条件下で
ABI PRISM 7500 Fast real-time PCR システム(アプライド バイオシステムズ)の
Fast SYBR green PCR master mixを用いて行った
(SYBR green 蛍光発色色素 特定のヌクレオチドに結合
欠点としては、プライマー二量体のような非特異的な二本鎖DNAも検出してしまうこと、マルチプレックス解析が行えないこと
プライマー二量体が非特異的に検出されていないかを確認するためには、融解曲線分析を行う。
SYBR Green法 は二重らせんDNA と特異的に結合する色素
DNA と結合すると青色光を 吸収し緑色光を発光する。
SYBRGreen を用いる real-time PCR は、発光を検出するから、
配列特異的なプローブを用意する必要がなく安価で手軽に行える
(プローブの設計や用意を必要としないため、プローブアッセーと比べ安価)
しかしSYBR Green は配列非特異的に 2 本鎖 DNA に結合するので、
プライマーの設計に特異性が求められる。
そのためSYBR Green 法ではPCR後に増幅産物を加熱して解離解析を行う
Two sets of primers were used, one to amplify SQLE alleles derived from A. vanbreuseghemii (qRT_erg1_2-F and qRT_erg1_2-R) and the other to amplify SQLE alleles derived from T. rubrum [qRT_erg(Tr)1_2-F and qRT_erg1_2-R] (Table 4).
2セットのプライマーが用い、1つは、A.バンブレセゲミ (qRT_erg1_2-F とqRT_erg1_2-R)
由来の増幅SQLE対立遺伝子へ、他の1つは、
紅色白癬菌 [qRT_erg(Tr)1_2-F とqRT_erg1_2-R] 由来の増幅SQLE対立遺伝子へ
用いられた(Table 4).
Dissociation curves of the q PCR-amplified products were plotted to confirm the absence of nonspecific products or primer dimers.
qPCR増幅産物の解離曲線は、非特異的生成物またはプライマーダイマーの
存在がないことを確認するためにプロットされた
Normalization was done to the 18S rRNA gene using two primers, 18S-1-F and 18S-1-R (33),
and relative quantification of gene expression was calculated according to the 2 Δ Δ C T (where CT is threshold cycle) method.
2つのプライマー 18S-1-F と 18S-1-R を用いて、18S rRNAへ行い、
遺伝子発現の比較定量法を
2δδCT法(CTはCt値)に従って、
割り出した
Expression levels of SQLE genes examined in six A. vanbreuseghemii transformants and four T. rubrum clinical isolates are indicated as relative fold changes compared to levels in the A. vanbreuseghemii parent strain 1062Av1401 or the wild-type T. rubrum strain CBS118892, respectively.
6つのA.バンブレセゲミ形質転換体と
4つの紅色白癬菌臨床分離株で調べられた
SQLE遺伝子の発現レベルは、各々、
A.バンブレセゲミ親株1062Av1401 または野生型紅色白癬菌株CBS118892
と比較した相対的倍数変化として示す
Statistical significance of SQLE gene expression levels among strains was evaluated using Student’s t test.
株の間のSQLE遺伝子発現の統計的有意差は、スチューデントのt検定を用いて評価した
Nucleotide sequence accession number. ヌクレオチド塩基配列 受け入れ番号
The nucleotide sequence of the A. vanbreuseghemii SQLE (AvSQLE) locus containing the ORF was deposited in the GenBank under accession number KU242352.
ORFを含むA.バンブレセゲミSQLE(AvSQLE)遺伝子座の核酸配列は、
受け入れ番号KU242352のもと、
ジェンバンクに預けられた
3日後、各株から増殖菌糸は採取され、凍結され、
マルチビーズショッカー(安井器械)を用いて1,800rpmで10秒間、液体窒素下で粉砕され、それを3回繰り返した
Total RNA was extracted using an RNeasy Plant minikit (Qiagen) and was treated with DNase I (Invitrogen).
全RNAが、RNeasy Plant minikit(キアゲン)を使い抽出され、
DNase I (インビトロジェン)で治療された
First-strand cDNA was synthesized using a
high-capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems).
cDNAの第一鎖(First-strand)が
high-capacity RNA-to-cDNA kit
(アプライドバイオシステムズ)を用いて合成された
The quantitative real-time reverse transcription-PCR (qRT-PCR) analysis was performed using Fast SYBR green PCR master mix on
an ABI PRISM 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems) under standard conditions, according to the manufacturer’s recommendations.
定量的リアルタイム逆転写PCR(qRT-PCR)解析は、
メーカー推奨事項に沿った標準条件下で
ABI PRISM 7500 Fast real-time PCR システム(アプライド バイオシステムズ)の
Fast SYBR green PCR master mixを用いて行った
(SYBR green 蛍光発色色素 特定のヌクレオチドに結合
欠点としては、プライマー二量体のような非特異的な二本鎖DNAも検出してしまうこと、マルチプレックス解析が行えないこと
プライマー二量体が非特異的に検出されていないかを確認するためには、融解曲線分析を行う。
SYBR Green法 は二重らせんDNA と特異的に結合する色素
DNA と結合すると青色光を 吸収し緑色光を発光する。
SYBRGreen を用いる real-time PCR は、発光を検出するから、
配列特異的なプローブを用意する必要がなく安価で手軽に行える
(プローブの設計や用意を必要としないため、プローブアッセーと比べ安価)
しかしSYBR Green は配列非特異的に 2 本鎖 DNA に結合するので、
プライマーの設計に特異性が求められる。
そのためSYBR Green 法ではPCR後に増幅産物を加熱して解離解析を行う
Two sets of primers were used, one to amplify SQLE alleles derived from A. vanbreuseghemii (qRT_erg1_2-F and qRT_erg1_2-R) and the other to amplify SQLE alleles derived from T. rubrum [qRT_erg(Tr)1_2-F and qRT_erg1_2-R] (Table 4).
2セットのプライマーが用い、1つは、A.バンブレセゲミ (qRT_erg1_2-F とqRT_erg1_2-R)
由来の増幅SQLE対立遺伝子へ、他の1つは、
紅色白癬菌 [qRT_erg(Tr)1_2-F とqRT_erg1_2-R] 由来の増幅SQLE対立遺伝子へ
用いられた(Table 4).
Dissociation curves of the q PCR-amplified products were plotted to confirm the absence of nonspecific products or primer dimers.
qPCR増幅産物の解離曲線は、非特異的生成物またはプライマーダイマーの
存在がないことを確認するためにプロットされた
Normalization was done to the 18S rRNA gene using two primers, 18S-1-F and 18S-1-R (33),
and relative quantification of gene expression was calculated according to the 2 Δ Δ C T (where CT is threshold cycle) method.
2つのプライマー 18S-1-F と 18S-1-R を用いて、18S rRNAへ行い、
遺伝子発現の比較定量法を
2δδCT法(CTはCt値)に従って、
割り出した
Expression levels of SQLE genes examined in six A. vanbreuseghemii transformants and four T. rubrum clinical isolates are indicated as relative fold changes compared to levels in the A. vanbreuseghemii parent strain 1062Av1401 or the wild-type T. rubrum strain CBS118892, respectively.
6つのA.バンブレセゲミ形質転換体と
4つの紅色白癬菌臨床分離株で調べられた
SQLE遺伝子の発現レベルは、各々、
A.バンブレセゲミ親株1062Av1401 または野生型紅色白癬菌株CBS118892
と比較した相対的倍数変化として示す
Statistical significance of SQLE gene expression levels among strains was evaluated using Student’s t test.
株の間のSQLE遺伝子発現の統計的有意差は、スチューデントのt検定を用いて評価した
Nucleotide sequence accession number. ヌクレオチド塩基配列 受け入れ番号
The nucleotide sequence of the A. vanbreuseghemii SQLE (AvSQLE) locus containing the ORF was deposited in the GenBank under accession number KU242352.
ORFを含むA.バンブレセゲミSQLE(AvSQLE)遺伝子座の核酸配列は、
受け入れ番号KU242352のもと、
ジェンバンクに預けられた