该方法转自bio-protocol网站，原作者：Lin Fan
摘要
稳定细胞系构建的步骤，方法是Lipofectamine转染，细胞是Caco-2。
材料与试剂
1. Caco-2细胞
2. Lipofectamine TM转染试剂
3. Dulbecco改进的Eagles Medium（DMEM）
4. 胰蛋白酶EDTA
5. Opti-MEM
6. 2x FBS
7. G418
8. 胰蛋白酶
9. 克隆环，真空润滑脂（全部高压灭菌）
10. 胰蛋白酶
设备
1. 组织培养罩
2. 培养皿（VWRI）
3. 10 cm的培养皿
4. 组织培养箱
5. 24孔培养板
6. 镊子（高压灭菌）
稳定细胞系构建步骤
1. 提前48-72 h在10cm培养皿中制备Caco-2细胞，使其在转染时可以达到50-70%汇合。
例如，如果在10 cm培养皿中以30%汇合接种，48 h后细胞将融合60%，如果在10 cm培养皿中以15%汇合接种，则细胞将在72 h后融合60%。
笔记：
与其他癌细胞系不同，Caco-2细胞非常缓慢地附着培养皿，因此总是允许细胞至少48 h生长至目标汇合。
如果使用小于10 cm的培养皿，请测试生长速度，因为Caco-2细胞的生长速度在不同程度上较慢，具体取决 于培养皿的大小。
2.转染细胞如下：
准备混合物A和B（见表），然后混合在一起，在室温下放置45 min。
将C加入AB混合物中。
用平板中的D替换生长培养基，逐滴加入ABC混合物，同时轻轻旋转平板。孵育37 ℃，5% CO 2 5 h。
将E加入培养皿中，再长1 h（总转染时间为48 h）。
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A |
B |
C |
D |
E |
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DNA (pmol) |
Opti-MEM |
Lipofectamine |
Opti-MEM |
Opti-MEM |
DMEM |
DMEM |
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1.125 pmol |
508.5 μL |
40.68 μL |
508.5 μL |
1525.5 μL |
2542.5 μL |
5.1 mL |
3.在培养8 h后，将细胞分成10 cm培养皿，选择培养基为1，1：10，1：100和1：1,000稀释的细胞。在pGL4.17的情况下，使用1 mg / ml的G418。
4.在3 weeks后，肉眼可以看到单菌落。此时，在中等颜色变化时更换介质。一旦菌落变得可见，可以选择单个菌落，或根据目的汇集菌落。有关单菌落程序，请参阅以下步骤：
用PBS洗涤板然后吸出。
用镊子取一个克隆环，然后将其短暂浸入真空润滑脂中，使润滑脂位于环的边缘，但不在中心。放置克隆环，使菌落位于中心，确保环均匀地贴在培养皿上。在想要选择的所有菌落上重复此操作，通常每个构建体有12个菌落。但要避免让培养基变干。
向每个中加入50-100 μL胰蛋白酶，并在37 ℃，5% CO 2下孵育5 min。
将含有FBS的DMEM添加到环中，上下移液并将细胞转移到具有选择培养基的24孔培养皿中。
允许细胞大约1 week生长至90%汇合。检查两者之间的细胞汇合，以避免细胞过度拥挤。
一旦24孔板中的细胞达到80-90%汇合，将细胞转移到具有选择培养基的6 cm培养皿中。同时，根据您的实验设置保存一些细胞进行表达测试。
一旦6 cm培养皿中的细胞达到汇合，就会产生液氮。