宮廷の人々が、国王エンリーコがすでに王妃アンナを見捨て、新たな女性に夢中になっていることを噂をしている(「王は来られたのか？」 Né venne il Re?)。そこへ、王妃が信頼する侍女であるジョヴァンナがやってくる。しかし、彼女こそ国王の新しい愛人である。自分を信頼する王妃を裏切っていくことに罪の意識をいだくジョヴァンナ(「王妃が私をお呼びになった」Ella di me sollecita)。そこへアンナが現れる。沈む気持ちを慰めるために、小姓であるスメトンに歌を所望する。ひそかに王妃を愛するスメトンは、その気持ちを託して歌う(「ああ、取繕わないで」 Deh non voler costringere)。しかし、王妃は耐えきれなくなりそれを止める。王の心変わりと王妃としての栄華のはかなさを悲しむアンナ(「ああ、この純真な若者は」Come, innocente giovane )。夜明け近くなり、もはや国王が来ないと悟った彼女は、眠りに就くために退場する。ジョヴァンナ以外の人々も王妃に付き添う。1人残るジョヴァンナの元に国王エンリーコがやってくる。王は、アンナと離婚しジョヴァンナを王妃に迎えようとしている。王妃になれば、この世の栄華を共に分かち合えると囁く国王(「余の持つすべての光は」Tutta in voi la luce mia)。それに対して、ジョヴァンナは、このような神に祝福されない関係を断ち切りたいと懇願する。王妃の元に戻るよう願うジョヴァンナに対しエンリーコは「アンナは余を裏切っていた」として、暗に婚姻の解消をほのめかす。王のたくらみを恐れるジョヴァンナだが、王を止めることはできない。
第1幕第2場：昼。ウィンザー城内の庭園
別々の方向から、ペルシーとアンナの弟ロシュフォールが登場する。ペルシーは、アンナのかつての恋人であったために、国王より追放され、亡命生活を送っていた。しかし、今度赦免されることになり、ウィンザー城へやってきたのだ。王がアンナから心変わりをしたことを噂で聞いたペルシーは、かつての恋人の身を案じる。彼は、まだアンナを愛し続けていることをロシュフォールに告白する(「彼女を失ったあの日から」Da quel dì che, lei perduta)。ロシュフォールは、そんな親友の身を案じる。狩りが始まる音が聞こえ、国王、そして王妃がやってくる。国王は、ペルシーに今度の赦免は王妃のとりなしであると囁く。喜ぶペルシーだが、国王の表情を見たアンナや宮廷の人々は国王が一体何を企んでいるのかと、不安がる(「私は感じた、この手の上を」Io sentii sulla mia mano)。国王は、武官のエルヴェイに王妃やペルシー達を監視するよう、命じて狩りへ出発する。
第1幕第3場：ウィンザー城内のアンナの私室へ通じる控えの間
アンナの小姓スメトンは、密かに盗み出したアンナの肖像画を見つめ、アンナへの思いを歌う(「ああ、恍惚の余り Ah, parea che per incanto」 )。スメトンは、盗んだ肖像画を返すつもりで、ここへ来ていた。しかし、人が来る気配がするので、カーテンの後ろに隠れる。そこへ、アンナとロシュフォールがやってくる。ロシュフォールは、アンナにペルシーに会うよう頼み込む。最初拒否したアンナだが、弟の頼みを断れず会うことにする。ペルシーは、アンナへの愛を告白する(「国王が君を憎んでも、私は君を今でも愛している」S'ei t'abborre, io t'amo ancora)。二度と会わないと拒むアンナに、ペルシーは剣を抜いて自殺しようとする。驚いたスメトンがカーテンから現れる。あまりのことに気絶するアンナ。そこへ、国王の登場が告げられ一同は恐怖する。エンリーコがエルヴェイと廷臣たちを連れて現れる(「皆、黙っておるのか、震えているのかTace ognuno, è ognun tremante」) 。無実を訴えるアンナだったが、国王は「言いたいことは判事の前でするがよい」と冷酷に語り、衝撃を受けるアンナやほかの人々の逮捕を命じる。
