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性格は穏やかで心優しいが、やや内気かつ臆病であり、天然でおっちょこちょいな一面が目立つ。他にも、日記を付けていたり（『マリオストーリー』より）、帽子は手洗いに限る（『ルイージマンション』より）といった拘りを持っていることから、マメな性格である事が窺える。一人称は「ボク」（任天堂の公式での場合。アニメ版等では「オレ」や「ワタシ」の場合もある）で、基本的に柔らかめの口調で喋る。お化けや怪物といった類のものが大の苦手。
また、初期の頃は無鉄砲という性格（『スーパーマリオブラザーズ2』の説明書より）があり、ファミコンからスーパーファミコン時代の漫画やゲームブック、および後述のアニメ映画では、基本的にそのような性格を基準として描かれていた（長期連載となっている沢田ユキオの漫画版のルイージは、近年ではゲームに近い描写へ変化している）。なお、沢田や吉田戦車の漫画では「二番手、報われない」ということがゲームで強調される以前から何かと災難を受ける扱いをされていた。このように、出番こそはマリオより少ないが性格の設定は古くからなされている。