先日、モデルナのワクチンの中から金属片が検出されたというニュースが駆け巡りました。
その後、群馬でも異物が見つかったり、
異物混入と同時期に製造されたワクチンを接種した30歳と38歳の男性が接種後に亡くなっているニュースが報道されました。
例えこれが、異物が直接的な原因ではなかったとしても、追究して製品の安全性を問い詰めていく過程で、問題と判断されれば中止にもできますし、異物化するような物質が入っているともなれば、そもそもの「被害」として、本来の緊急使用許可のルールには当てはまらずに、製薬会社に責任を取ってもらう事も可能となります。
あくまで、製品に問題が無かった場合しか責任を取らなくていいルールのはずですからね。
そして、その異物ができる原因として、こんな情報がありました。
異物混入のカラクリ
— KENKEN (@NURSE_KENKEN) August 28, 2021
💉準備時のマニュアルより
生食で希釈時にバイアルを
・十回「静かに」逆さにして混合
・振らないで下さい
Dr、Ns、製薬会社しか
知り得ない内容
振ったり衝撃与えたり
雑に扱うと
磁性ナノ粒子が
バイアル内で凝集し
異物となり
目視出来るようになる
全てのロットで
共通 https://t.co/X4CYu9sP3o
▼モデルナの実際の資料
https://www.modernatx.com/covid19vaccine-eua/providers/storage-handling.pdf
（日本用資料）
▼ファイザーの資料
Twitterの方は、生食で希釈と書いているので、ファイザーのものを元にして書いている可能性がありますが、一番大事なのは、
「振ったり衝撃与えたり 雑に扱うと 磁性ナノ粒子が バイアル内で凝集し 異物となり 目視出来るようになる」
という部分。
磁性ナノ粒子→酸化グラフェンではないか？ということ。
という事は、
もしかしたら血液中でも振動を与えたら同じことが起きたりはしないのか？という疑問。
瓶ではないから起きないと思っていて問題ないものなのか。
臓器にワクチンの成分が集中すると言われるのは、臓器が動いて振動を発しているからだったりはしないか。
もはや、ワクチンが届いた時点で振られている可能性がありますし、日本は地震も多いし、近くに電車が走っていたり、工事していたら、微振動を受けてしまうこともありますからね。
とても扱いにくいワクチンだなと。。。
以前、ワクチンのデリバリーシステムとして酸化グラフェンが使われているんじゃないかと紹介したこの文献や、
「酸化グラフェンをPEGに合成する技術とそれを使用したコロナワクチンの特許を中国が取得済み」にも書きましたが、
今回、情報を調べていたら、こんな文献に出会いました。
元記事によると、2018年にイギリスで発表されたもので、あくまで、バイオコロニーの話のようですが、機械翻訳だとわかりにくかったので、発掘した元記事をシェアします。
酸化グラフェンが血液に触れる：生体内コロニー化された2次元材料の生体内での相互作用
概要
酸化グラフェンは、この10年間の生物医学・薬学研究の中で最も注目されているテーマである。しかし、ヒトの血液成分との複雑な相互作用が、有望なin vitroの結果から臨床現場への移行を複雑にしている。酸化グラフェンは、人間の臓器、組織、細胞と同じ原子でできているにもかかわらず、その二次元的な性質のために、血液タンパク質や生体膜と独特の相互作用を起こし、血栓症や免疫細胞の活性化などの深刻な影響を引き起こす可能性がある。この総説では、血流に注入された後の酸化グラフェンの旅路について、血漿タンパク質との初期相互作用から「生体分子コロナ」の形成、そして生体内分布までを説明する。酸化グラフェン（およびその官能化／還元誘導体）の化学的特性と、タンパク質との結合および生体内反応との関連について考察する。また、生体分子コロナがこれらのプロセスに及ぼす影響についての現在の知識を踏まえて、生体内分布と毒性に関するデータをまとめます。我々の目的は、酸化グラフェンコロナに関する未解決の問題に光を当て、将来のドラッグデリバリー技術の発展のための基盤を築くことである。
→血栓症や免疫細胞の活性化
まさに、コロナウイルスやワクチンの有害事象と類似していますね。
「免疫細胞の活性化」とは、サイトカインストームのことでしょうか？
あまり詳しくないので、間違いはご了承ください。医療従事者の方なら心当たりのある現象があると思います。
→酸化グラフェンコロナ
英語表記は「the graphene oxide corona」なので、「COVIT-19」ではないですが、奇遇ですな！
ドラッグデリバリーは前出のワクチンのあれのことですよね。。。
1. はじめに
～中略～
この総説では、これらの矛盾に光を当て、自由に浮遊している酸化グラフェン（GO）の単分子層の生体内界面に関する現在の知見をまとめる。ここでは、GOに焦点を当てる。GOは、低コストで製造でき、親水性であることから、他の炭素材料よりも優れているからである4 。GOの生体への影響は、その還元体である還元酸化グラフェン（rGO）と比較されることが多い。GOと同様に、rGOもいくつかの方法で得ることができ、C/O原子の比率が変化することで特徴づけられる。いくつかの研究では、GOは、rGOとは異なるGBMと比較されている。このレビューでは、原著論文で使用されている命名法に従うとともに、読者が比較しやすいように利用可能なサイズデータを記載します。
ナノマテリアルの生体内での運命は、一般的に、投与経路、ナノマテリアルの化学的性質、生理的環境など、いくつかの要因に影響されます5。横方向のサイズ、形状、投与量、曝露時間、層数、化学組成、表面電荷、安定性、純度、表面機能性など、数多くの物理化学的特性が、材料が血液タンパク質の豊富な環境にさらされる注射後の運命に影響を与えます6。血液中のタンパク質は、ナノマテリアルの生物学的な「アイデンティティ」を即座に、かつ劇的に変化させる。その結果、血液中の高分子のダイナミックなシェルからなる新しいインターフェースが形成される。この層は、タンパク質が濃縮されていることから、通常、タンパク質コロナまたは生体分子コロナ（BC）と呼ばれている7。BCは、細胞との相互作用、取り込みとクリアランスを決定するため、生体内分布と意図した標的部位への送達に影響を与える8。
GOのBCはまだ十分に解明されておらず、この層がin vitroおよびin vivoの効果に及ぼす影響を検討した研究はほとんどない。ここではまず、GOの表面の特徴と、アミノ酸や血中タンパク質の結合との関連性について説明します。次に、GOのBC組成と、BCが血球との相互作用にどのような影響を与えるかについて説明する。最後に、生体内分布とバイオセーフティーに関する懸念、およびGOをベースとした静脈注射用医薬品システムの開発に関連する将来の課題について説明します。これらの側面を理解することは、注射可能な生体適合性GOの将来の設計に関わり、改善されるでしょう。
2. GOおよびrGOの化学的性質
GOは、グラファイトの酸化・剥離によって得られた化学修飾グラフェンであり、rGOは、原始グラフェンに最も近い材料を得るために、いくつかの可能な還元プロトコルを用いてGOから製造されます3。rGOは、高温（900℃以上）での熱還元4、還元剤（水素化ホウ素、水素化アルミニウム、水素酸、硫黄含有還元剤など）による化学還元2、水熱還元、電気化学的還元、バクテリアを介した還元10などの方法で得られる。
GOは、主に炭素、酸素、水素原子で構成されており、C/O比は約1.5～2.5である。広く受け入れられているLerf-Klinowskiモデル（文献11から引用した図1a参照）に基づくと、GOの底面にはヒドロキシル基とエポキシド基が多く存在し、端面には主にカルボキシル基とカルボニル基が存在する。さらに、GO平面内には2つの領域があり、1つは軽度の官能基を持つ炭素（主にsp2ハイブリッド炭素（グラフェン様））からなる領域、もう1つは高度に酸素化された炭素（主にsp3ハイブリッド炭素）からなる領域である12。興味深いことに、80℃で1～9日間の熱アニーリングを行うと、表面基の分布が変化する。アニール中、酸素官能基のクラスターが、rGOに還元されることなく、GO表面に生成される（酸素含有量は約30％）13。
GOの豊富な表面酸素基は、タンパク質、酵素、ペプチド、バクテリア、細胞、核酸などの外部種を結びつけるための多くの反応部位を提供します12,14。
11,15,16 rGOは、実際にはより不安定で疎水性であり、溶液中で凝集体を形成する傾向があります17。
GOの表面にある基は、共有結合を介した化学修飾のユニークな機会を提供し、機能化されたGOを得ることができます。GOの機能化は、端部の機能化（カルボキシル基）と基底面の機能化（水酸基とエポキシ基）の2つのカテゴリーに分けられる。詳細は他のレビューを参照してください。11 多くの場合、GOの機能化は、元のポリマーの熱的および機械的安定性を高めるために、GOベースのポリマー複合体を構築するために使用されます。これらの複合体は、ポリマーとGOの間の水素結合やファンデルワールス力を利用して、GOの官能基を共有結合で修飾するか、または非共有結合を介して製造することができます11,20。また、GOやrGOへのタンパク質の吸着は、共有結合または非共有結合を介して起こります。共有結合は、アミノ酸の側鎖とGOの表面に存在する官能基との化学反応に基づいています。
血液中では、弱いファンデルワールス力、疎水性、静電性、およびπ-πスタッキング相互作用によって、非共有結合的な吸着が起こります。また、GOの基底面にはπ電子が豊富に存在するため、π-πスタッキング相互作用が可能になります。同時に、GOの酸素基は、その組成が調製条件や保存条件に厳密に依存するため2、水素結合や静電結合が可能になります12。GO上の結合は、ファンデルワールス相互作用によっても媒介されます23。しかし、静電的相互作用はGO上でより顕著ですが、ファンデルワールス相互作用と静電的相互作用の両方が、表面の非官能化領域の増加により、rGO上のタンパク質の吸着に大きな役割を果たします24。
3. 血液中のタンパク質とGOおよびrGOの相互作用
～中略～
蛍光消光のデータから、消光効率、会合・解離定数、結合協同性などを推定することができます6,30。最近、GOと蛍光分子の距離を調整するチューナブル・シリカ・スペーサーを用いた手法により、GOの消光メカニズムが調べられました31。非常に短いドナー・アクセプター間の距離では電子の交換が起こりますが（Dexter transfer）、距離が長くなると主な消光メカニズムはフェルスター移動（FRET）となり、GOをアクセプターとした場合には10nmを超える距離でも効率的に消光します31。血漿タンパク質の蛍光は、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)の3つの芳香族残基に依存するが、Trpが吸収と固有の発光の主な原因となっている。Trpの蛍光は、その局所的な微小環境に強く影響され、非常に敏感である。Trpがタンパク質の疎水性コアにあるときは蛍光が強く、親水性の溶媒にさらされているときは蛍光が弱い。一般に、GOはアルブミン、グロブリン、フィブリノゲンの3つの血漿タンパク質のTrpを消光する。しかし，3μg mL-1以下の濃度では，フィブリノーゲンの蛍光を選択的に増幅することがわかった。Kenryらの研究で説明されているように、アルブミンとグロブリンのサイズが小さいと、GOナノシートによる物理的な包み込みと、π-πスタッキングと相互作用によるGOとプラズマタンパク質間のエネルギー移動により、効率的なクエンチングが可能になる32。逆に、フィブリノゲンのサイズが大きいと、低濃度ではGOの包み込みができない。逆に、フィブリノゲンのサイズが大きいため、低濃度ではGOのラッピングができず、GOによるフィブリノゲンの凝集のおかげで、フィブリノゲンの固有の蛍光がわずかに増加する。この研究は、GOとGBMのナノ材料について、研究者が方法を慎重に選択し、濃度依存性の効果を評価する必要があることを示しています33。
※細かい実験データは原文をご確認ください。
このデータは、タンパク質が部分的に展開して炭素質表面に吸着すると、表面原子だけでなく、埋もれた残基も現象に関与していることを示している25。血液タンパク質の吸着には、アルギニンなどの塩基性残基も同様に重要な役割を果たしていることが観察された37,38。
～中略～
血漿中に2番目に多いタンパク質であるγ-グロブリンは、GOとの相互作用後も安定していますが、相互作用するGOシートのサイズ（約100 nm～約1000 nm）による影響はほとんどありません。高濃度の場合にのみ、γ-グロブリンはより大きなGOシート（約1000 nm）によく吸着し、5 mg mL-1までの濃度では、グロブリンは結合部位が飽和し、上澄み液には見られない6。凝固系の大きなタンパク質であるフィブリノゲンは、GOで変性し、より小さなGOシートによく吸着する6。
Chongらは、GOとrGOの両方において、吸着の順番は、フィブリノーゲン＞免疫グロブリン＞トランスフェリン（生体液中の遊離鉄レベルをコントロールする鉄結合血漿糖タンパク質）＞アルブミンであると報告しています25。Chongと同様に、GOとrGOに対するBellingの研究では、タンパク質の吸着の順番は、補体因子H＞IgG＞アルブミンとなっています26。これらのデータは、非常に低い濃度（0.5 mg mL-1）でもアルブミンが上澄み液に現れ、続いてグロブリン、フィブリノゲンが現れ、それぞれ5 mg mL-1、10 mg mL-1で上澄み液に見えることから、Kenryの研究と一致しています（図1bおよび参考文献6）。
～中略～
GOの方がアルブミンの負荷が高いことを指摘している26。この効果は、IgGと補体因子Hではあまり見られなかったが、GOは一般的にタンパク質をよりよく吸着するようである（Fig. Chongはこの影響を考慮し、利用可能な表面に吸着したタンパク質のミリグラム数を正規化したところ、意外にもrGOの方がタンパク質の搭載効率が高かった（図2c）。これは、π-π相互作用と疎水性相互作用がタンパク質結合時の主な駆動力であるという考えと一致する (Chong, Ge et al., 2015).25。
～中略～
まとめると、GOの吸着容量は、芳香族残基の含有量、タンパク質のサイズ、疎水性に影響されます。フィブリノーゲンはGOによるアルブミンよりも優れた吸着性を示し、酸素の少ないGNPはアルブミンをよりよく吸着する。タンパク質のアミノ酸と酸素濃度の低いGBMとの間の疎水性相互作用は、これらのナノ材料の不安定性のためにあまり好まれない。タンパク質の吸着に及ぼす表面基やナノ材料の分散性の影響を明らかにするには、さらなる系統的な研究が必要である。
4. GOの生体分子コロナの構成
体内に注入されたGOが移動する際、最初に起こるプロセスは間違いなく血漿タンパク質が表面に結合することである（図3-1参照）。静脈内に注入されたナノ粒子は、侵入者を中和するための複数の防御ラインに遭遇します。最初の、そして最も重要な防御ラインは、血液タンパク質の吸着と生体分子コロナ（BC）の形成である41。私たちの体内に存在する数千のタンパク質のうち、10～50のタンパク質がナノマテリアルのBCに関与する可能性がある42。少なくとも1つのナノマテリアルBCで確認された血液タンパク質のサブセットは、「アドソルボーム」と名付けられている43。アドソルボームは、全タンパク質質量の10%という閾値で高含有量と低含有量に分けられた合計125種類のタンパク質で構成されている。BCは、最大6種類のタンパク質が高含有量で吸着され、それ以外の多くのタンパク質が低含有量で吸着されるという一般的な構造をとっているようだ。BCは種特異的であり、ヒトとマウスのBCに共通するタンパク質はわずかしかない42。
～中略～
rGO、プリストン・グラフェン、およびGOは、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、そしてもちろん血漿や血清中では凝集しやすい17,33,44。この問題を解決するために、ポリスチレンウェル内の固体基板上で、あるいはヒト血清中でグラファイトを直接剥離した後に、純粋なグラフェンのBC（G-BC）を分析した。著者らは、化学的気相成長法によって得られたグラフェン基板（G-基板）上で、ヒトの血漿濃度を2％から70％45まで試験し、血漿濃度がBCの組成に影響を与えることを見出した。血漿濃度が5％以下の場合、G基板に付着したタンパク質はアルブミンのみであった。血漿濃度が高くなると、まずプロトロンビンとα-フェトプロテインがBCに付加され、次にビタミンD結合タンパク質とフィブリノーゲンβ鎖がBCを豊かにした。最高の血漿濃度で吸着したタンパク質は、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖、トロンボスポンジン-1、補体成分C7、プロトロンビン、血清アルブミン、α-フェトプロテイン、フィブリノーゲンα鎖、C4b結合タンパク質α鎖、キニノゲン-1、ビタミンD結合タンパク質、フィブリノーゲンβ鎖、およびチトクロームであった45。
この方法は、グラフェン表面に吸着層を形成してBC組成に影響を与える分散剤の使用を避けるために、Castagnolaらによって開発されたものである46。この方法は、10 w/v%の天然フレーク状グラファイトを異なる濃度の血清溶液に分散させ、バスソニケーターを用いて1～4時間の超音波処理を行うものである。
この論文では、G-BCはアルブミン、リポタンパク質（主にアポリポタンパク質A-1（ApoA-1）とアポリポタンパク質E（ApoE））、ビトロネクチンで構成されていることを明らかにした46。血清濃度はG-BCの組成にわずかに影響を与えるようである。46,47 固体または可溶性のグラフェンでは、利用可能な表面やその他の物理化学的特性が異なることが知られているが、コロナの組成が著しく異なるのは、実験に使用したタンパク質源、すなわち血漿と血清に起因する可能性がある45,46。実際、ナノ材料を血清中で培養すると、主にアポリポタンパク質からなるBCが形成されることが知られているが、血漿中では凝固因子や補体因子も関与している可能性がある48。
GOと他の炭素系ナノ材料（カーボンブラック（CB）や多層カーボンナノチューブ（MWCNT））の血清BCを直接比較したところ、GOは疎水性が低いためアルブミンに対する親和性が最も低く、血清中の低濃度タンパク質に対する吸着能力が高いことが分かりました49。これらのデータは、前節で述べたKenryによる単一タンパク質の研究と一致しています6,40。別の研究では、ウシ胎児血清（FBS）中で形成されたBCは、表面基が減少するとタンパク質の吸着が減少し（rGO）、材料濃度が高いと吸着効果も低下することが示されています50。CBやMWCNTに関しては、より多量のタンパク質、特に補体成分や血液凝固タンパク質がGOコロナに吸着されます。著者らは、このタンパク質濃度の高さについて、GOの表面曲率の低さと、負に帯電した官能基と高表面積の利用可能性が組み合わさったものと説明している。49,51 GO-BCで同定されたタンパク質は、主に輸送と免疫反応に関与している。49 調査したすべてのナノ材料は、補体因子とアポリポタンパク質（血液脳関門を通過するターゲティングとトランスロケーションに関与）に富むBCを有していたが、アポリポタンパク質-EはGOに選択的に吸着された。49 タンパク質の定性分析によると、他のナノ粒子でも実証されているように、GOのBCは献血者の健康状態に影響されることがわかった52,53。実際、低フィブリノゲン血症、血液がん、大サラセミア、小サラセミア、リウマチ、フォービズム、高コレステロール血症、糖尿病、妊娠など、さまざまな疾患・条件の患者の血漿とGOシートをインキュベートし、ゲル電気泳動で分析したところ、BCの組成に大きな違いが見られた。これらの違いは、血漿タンパク質の組成・含有量、タンパク質のコンフォメーション、および/またはタンパク質の溶解度の変化に起因すると考えられている52。
GO をヒトの血漿中に長期間 (14 日間) 浸漬すると、フリーラジカルを介して生体内変化が起こり、rGO に還元されます。オルニチン、オクタデセン酸、ドデカノール、タロース、テトラデカン酸などの一部の分子は、GOに選択的に集積する。
表面改質は、GOの生体適合性を向上させ、BCの形成を制御するために一般的に採用されている手法である。
Tanらは、血清タンパク質とGOおよびnGO-PEG（10kDaのアミン末端6本鎖ポリエチレングリコール（PEG）でアミド形成により機能化したナノメートルサイズのGO）との相互作用を比較した55。nGO-PEGは、特異性なく大量の血清タンパク質を吸着するGOとは異なり、4つの免疫関連因子（C3a/C3a（des-Arg）、クラスターリン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ビトロネクチン）と2つの凝固因子（含まれる血小板因子4とトロンビン）の計6つのタンパク質に対して、タンパク質の結合を抑え、選択性を示した。しかし、トロンビンと血小板第4因子の循環レベルは極めて低いが、血清調製時の凝固プロトコル中に3桁以上増加することから、トロンビンと血小板第4因子の関連性は擬似的な効果である可能性がある55。さらに、nGO-PEG（ナノメートルサイズのフレーク）とGO（マイクロメートルサイズのフレーク）のサイズの違いを考慮すると、上記の相互作用に対する潜在的なサイズ効果を調査する必要がある。
Xuらは、マウス血清中のGO-BCの組成に対するGOの表面修飾の効果を測定した（図4）。GOを化学的に修飾して、水加ヒドラジンを還元剤とするアンモニア中のGO分散液で調製したアミノ化GO（GO-NH2）、GO-ポリアクリルアミド（GO-PAM）、GO-ポリアクリル酸（GO-PAA）、GO-PEGを得た。
GO(100%)とGO-PAM(90.2%)は、GO-NH2(54.3%)、GO-PAA(39.3%)、GO-PEG(43.9%)に比べて高いタンパク質吸着性を示しましたが、これは表面電荷と疎水性の違いによるものと推測されます。BCに含まれるIgGの相対量は、他のタンパク質よりもはるかに多く、GO（62.2%）、GO-NH2（58.3%）、GO-PAM（52.3%）、GO-PAA（36.8%）、GO-PEG（30.2%）の間で大きな差が見られた56。表面修飾の影響を受ける他のタンパク質としては、トロンボスポンジン1、ゲルゾリン、ヘモグロビン（GOでは少ない）が挙げられる56。
GO-BCを修飾する別の機能化戦略では、キトサン(CS)とGOが静電相互作用によって自発的に自己組織化し、CS-GOを形成することが予想されます。このCS-GOは、BSAとリゾチームの吸着能力を低下させ、FBSでは血清タンパク質の取り込みを低下させます57。
以上のことから、G-BCの組成は、ナノ材料の状態とタンパク質の供給源の両方に影響される。Castagnolaらの研究46は、注入された原始的なグラフェンのBCの構成をある程度規定しており、アポリポタンパク質の濃縮は、（結論で述べたように）標的送達の応用に役立つかもしれないと推測することができる。しかし、機能化されていないプリストグラフェンの不安定さは、このナノ材料のアキレス腱となっている。第6章で述べるように、GOを血液中に注入すると凝集体が形成されるが、その大きさと用量に依存している58。このことは、GOがより安定しており、注入型デリバリーシステムに適していることを意味し、その結果、BCを正確に制御する必要がある。これは、異物であるナノ材料を「マーク」するタンパク質が多ければ多いほど、人間の免疫系からの攻撃を受けやすくなるためである59。そのため、GOのステルス性を向上させるために、多くの機能化戦略が利用されている。実際、BCのタンパク質吸着率の高さを利用して、患者の血液中の濃度の低いバイオマーカーを選択・濃縮したり52、BCを利用した診断ツールを開発したりすることができる7。次に、GO-BCに含まれるタンパク質のリストには、ApoE、ビトロネクチン、クラスターリンが含まれています。これらのタンパク質は、血液脳関門（BBB）を誘導する重要な分子（ApoE）であると同時に、治療法のターゲットでもあります（表2）60-62。RGOのBCは、我々の知る限り、まだ完全には特性化されていませんが、BBBのパラセルラー・タイトネスが一過性に低下することで、脳に入ることができます63。
5. 5. バイオコロナートされた GO 材料の血液成分への影響
BCの組成は、他の血液成分との相互作用に直接影響します（図3-2）。例えば、ナノ粒子BCに抗体、補体、凝固因子が含まれていると、血液凝固カスケードを活性化する可能性があります。さらに、BCのコーティングは、ファゴサイトーシスを促進し、循環から排除することができる41。
まず、表3に示したGOと赤血球（RBC）の相互作用に関するデータを検討します。静脈内に注入されたナノ材料は、血液中に豊富に存在することから、他の細胞よりもまず赤血球と相互作用すると考えられます。溶血とは、赤血球が損傷してヘモグロビンが血中に漏出することをいう。溶血後、ナノ材料は放出されたヘモグロビンを吸着したり、細胞の残骸に付着したりして、マクロファージに排除される可能性が高まります8。GOやrGOのシャープなエッジにより、生体内で溶血作用が予想されます。これは、GOとバクテリアとの相互作用で報告されているように、ナノマテリアルのブレードが細胞膜を破壊することが原因と考えられます19。
～中略～
上述したように、生体内に注入すると、GOやrGOの周囲にBCが形成される（図3-1）。BCの組成にかかわらず、いくつかのグループは、GOと真核細胞の間にBCが物理的に存在しないことを実証している（図3-2a）。GO の溶血は、キトサン、デキストラン、クルクミンのコーティングや GO 表面の機能化によっても防止されます。(DAは、（1）表面の前処理なしに水溶液中で固体表面に付着する、（2）表面に付着したDAは、チオール基、イミノ基、アミン基を介して二次機能性バイオポリマーを固定することができる、（3）DAのカテコール基は、GOを化学的に還元されたrGOに変換することができる、といった多くの特性を持っています。Chengらは、これらの特徴を利用して、ヘパリンをグラフトしたpolyDA-rGO（Hep-gpRGO）およびBSAをグラフトしたpolyDA-rGO（BSA-g-PRGO）を得た。これらのpolyDA-rGOは、溶血比を大幅に抑制することができた（200μg mL-1という高濃度でも1.8%以下）。
このような対照的な結果は、GOと細胞に関する文献の中でも特異なものではないが、実験条件によって説明がつく。ほとんどの文献では、多くの細胞株に対するGOおよびrGOの細胞毒性は、細胞膜への浸透および/または酸化ストレス誘導が原因であることが実証されています6,72。しかし、RBCに関しては、GOがBSAまたはFBSとインキュベートされた場合、GOの極めて高いタンパク質吸着能力により、細胞膜への物理的損傷は大きく軽減されます14,25,39,73,74。以上のことから、細胞培養液中のタンパク質の存在は、細胞毒性の結果に影響を与え、GOおよびrGOの表面に豊富な保護膜が形成されている生体内では、GOおよびrGOは溶血性を示さないと考えることができます（図3-2a）。
止血カスケードは、傷ついた組織からの出血を防ぎ、血液の流動性を維持します。最終的な止血は、赤血球、凝集した血小板、フィブリン、その他の細胞要素の混合物である血栓を形成する血小板によって行われる（Fig.3-2b）。血栓が異常に形成されると、血栓症を誘発することになる。
血栓性とは、血液凝固を誘発し、血栓によって血管を閉塞させる性質のことで、生体内に投与するためのナノ材料設計において重要な評価項目となっています8。
さらに、全身循環時間が長くなるように設計されたナノ粒子は、凝固系を含む血液成分と接触する可能性が高くなり、血栓症のリスクを伴うことになります8。
また、GOは、50μg mL-1までは、血小板の凝集やフィブリノゲンの重合を阻害しないことが確認されている64。
これとは対照的な結果がSinghらによって報告されており、数層のGOシート（サイズは0.2～5μm）がin vivoで血小板の活性化と血栓塞栓症を引き起こすことが明らかになっています。GOは、非常に低濃度（2μg mL-1）で、細胞内に貯蔵されているカルシウムの放出、Srcファミリーの非受容体タンパク質チロシンキナーゼの活性化、血小板インテグリン-フィブリノーゲン相互作用の増強を介して、in vitro血小板凝集を引き起こしました。興味深いことに、rGOまたはGOをヘパリンコロナで覆うと、血栓塞栓症を回避することができる22,29。しかし、rGOはGOよりも安定性が低く、rGOの血栓塞栓症は低く、血管の8%しか閉塞しなかったことから、この仮説は捨て去るべきです77。別の説明としては、凝固因子がGOのコロナに吸着することで、その接触活性化が起こる可能性があります76。血栓性が抑制されるのと同じ濃度（250 μg kg-1体重）で、GOの表面基を変え、正電荷を帯びたアミン修飾rGO（N-GH2）を作ることで、血球との相互作用とBCの組成の両方に影響を与える可能性があります56,65。
49 in vitro GO補体活性化試験では、C3aフラグメント(GO濃度に比例)とC5aフラグメントの濃度上昇により、GOが補体活性化を有意に誘発することが示されました。
本研究では、ハマーズ法を用いてGOを合成し、穏やかに還元することで、酸素含有量が36％、29％、24％と異なり、サイズが数μmの3つのナノ材料を得た（AFMによる特性評価より）。その結果、C5aとSC5b-9の濃度が低下するなど、酸素濃度の低下により補体の活性化が抑制されることがわかった。これは、溶液中で不可逆的な凝集体を形成しやすい酸化度の低いGOでは、フレークが不安定になり、GO表面の露出が減少したためと説明できる。一方、この現象は、酸素型の機能性と、認識された分子への親和性や補体制御因子との相互作用を変化させるGO表面のしわから生じるトポロジー変化の複合効果によるものと考えられる79。GOによる補体活性化以下の濃度では、LPSによる反応はGOによって抑制された。おそらく、GOとLPSまたはGOとLPS結合タンパク質の直接的な相互作用によるものと思われる。この効果は、GOの濃度が補体活性化閾値以上になると消失し、IL-6サイトカインの放出が誘導されました79。ナノ材料を37℃で2時間、アルブミンまたは補体H因子のコロナと一緒にインキュベートした後に得られた、GOまたはrGOのプレコートは、補体活性化をそれぞれ40%および90%減少させることができます26。この興味深い効果は、補体成分との相互作用を立体的にブロックすることと、補体H因子コロナの場合は補体カスケードを制御することの両方によって媒介されている26。要約すると、GOは補体システムを活性化するが、酸素濃度の低下とBCによるプレコートがこの効果を妨げる可能性がある。
補体の活性化は、単核細胞による貪食を介して血流から速やかにクリアランスされることにより、生体内分布の変化をもたらす可能性がある。8 GO と免疫細胞との相互作用を理解することは、バイオメディカル技術の開発に不可欠であり、GBM が免疫系と相互作用する際に発生するメカニズムに焦点を当てた最近の興味深いレビューがいくつかあります。18,72,80,81 免疫活性化に関する結果は対照的ですが、GO のサイズ、酸化および機能化と免疫細胞への影響との間に厳密な関係があることは確かです。例えば、リンパ球、単球、樹状細胞を含むヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、75μg mL-1以下では、初代グラフェンまたはGOのいずれによってもインキュベーションしても、有意な刺激（増殖）／免疫抑制（細胞毒性）を示さなかった68。しかし、炎症性サイトカインの発現量を定量化したところ、初代グラフェンで処理したPBMCは、GOのサンプルに比べてIL-8とIL-6の発現量が相対的に高く、前者の炎症性の可能性が示された68。
最近の研究では、GOはサイズに依存して炎症性サイトカインの発現を誘導し、サイズの小さいGO（1μm未満）は大きいGO（1～10μm）よりも効果的であることが示された18,82。
ナノ材料のプロの食細胞であるマクロファージ（図3-2d）は、グラフェンと比較してGOをより良く取り込むようである。グラフェンは、水への分散性が低いためか、細胞表面でブロックされたままである。摂取されたGOシートは、マクロファージの細胞質内で凝集体を形成し80,85、炎症性サイトカインの産生を誘発する72,75,80。マクロファージの貪食作用は、GOシートの大きさに依存します。大きなシートは、細胞の膜と整列し、細胞を環境から隔離する「マスキング」効果を発現します86。この効果は、バクテリアの細胞を隔離して増殖を抑制する「ラッピング」効果に似ています19。
大きなGOシート(750-1330 nm)は、小さなGOシート(50-350 nm)と比較して、M1マクロファージの分極化、NF-κBの活性化、および炎症性サイトカインの産生を誘導することができます87。
単球およびマクロファージ前駆体について、分散性は似ているが酸化状態が異なる材料（サイズが100 nm未満のGOおよびrGOナノプレートレット）の効果を直接比較しました（図5）。GOナノ粒子は改良型ハマーズ法と超音波処理によって得られ、rGOは前者の紫外線光還元によって得られた88。rGOはGOに比べて摂取しやすいが、抗酸化酵素の発現パターンが異なる。曝露したTHP-1細胞の影響は、文献から再現したFig.5に示すように、THP-1aにも及ぶ可能性があります。88 GOナノ粒子（GONP）は、rGOナノ粒子（rGONP）と比較して、大腸菌に対するTHP-1aの食作用をより強く阻害し、GONPとrGONPの両方が、THP-1aの食作用とエンドサイトーシス能力を損なっていました。
BC効果については、マクロファージによる貪食作用は、IgGによってオプソニン化されたGOを認識するFcγ受容体によって媒介されると考えられています75。GOをPEGで表面修飾すると、GOコロナにおけるIgGの濃縮が抑えられるため、結果的にマクロファージの貪食作用が抑制され、生体適合性が向上します。しかし、他のタンパク質（補体C4、セロトランスフェリン、未知のタンパク質など）も特異的なリガンド・受容体相互作用を引き起こし、機能化されたGOの循環時間に影響を与える可能性があることにも留意する必要があります56。
その他の重要な食細胞として、樹状細胞(DC)があります。樹状細胞は、(i)抗原の捕捉、(ii)細胞内での処理、(iii)細胞表面のMHC複合体への抗原の提示を経て、抗原特異的T細胞を活性化します。
DCの成熟は、GOによって用量依存的に有意に誘導され、表面受容体の表現型のアップレギュレーションに反映されている85,89。しかし、GOで処理したDCは、リンパ球に抗原を正しく提示できなかった（図3-2e）。抗原の取り込みは変化しないが、GOは抗原の処理を担うイムノプロテアソームのサブユニットLMP7と直接相互作用する89。
50μg mL-1以下では、Tリンパ球の活性はGOやカルボキシル基に富むGO-COOHに影響されません39が、この濃度以上では活性が低下します。アポトーシスは、GO-COOHとGOのそれぞれについて、活性酸素依存性/非依存性のシグナルを介して、体内に取り込まれることなく、外部から誘導されるようです。アポトーシス誘導にもかかわらず、両ナノ材料はリンパ球の免疫応答能力を阻害しません。なお、細胞をGOまたはGO-COOHで処理し、細胞培地にFBSを含まない場合、細胞毒性は劇的に高くなり、ナノ材料の周囲に保護BCが形成されていることが示されています39。
90 一方、GOの免疫賦活作用と抗原吸着のための高い表面積は、ワクチン療法のアジュバントとしてのGOの利用に関する研究を後押ししている91,92。PEGとポリエチレンイミン(PEI)の両方で機能化したGO、GO-PEG-PEIは、Helicobacter pyloriに特異的なウレアーゼB抗原を樹状細胞に送達するための革新的な方法といえます。GO-PEG-PEIは、複数のToll様受容体(TLR)の活性化を通じて、インターロイキン12(IL-12)を放出するDCの成熟を著しく促進します92。
6. GOの生体内分布とバイオセーフティー：今後の課題
このレビューの焦点は、GOの医薬品デリバリーシステムの将来の設計に照らして、血液成分やBCとGOの相互作用です。これまでに開発された静脈注射による薬物送達システム（DDS）には、腫瘍のパッシブターゲティングのためのPEG化ナノグラフェンシート93、ドキソルビシン送達のためのキトサンおよび酸化鉄磁性ナノ粒子で機能化したrGO94、腫瘍内でのエピルビシン送達のための上皮成長因子受容体抗体結合PEG化ナノグラフェン酸化物55などがある（グラフェンを用いたDDSの包括的な見通しについては、文献95を参照）。薬物送達を目的としたナノ粒子は、クリアランスを減らして全身への循環時間を延ばすように設計されており、その結果、標的送達の機会を増やすことができる。しかし、循環時間が長くなると、血液成分との相互作用や副作用の発生の可能性が高くなるというデメリットがある。
ナノマテリアルを臨床治療に応用する前に、バイオセーフティ上の問題に対処する必要があります。GOが血液成分とどのように相互作用するか、またBCがこれらの相互作用にどのように影響を与えるかを見てきましたが、GOを静脈内（i.v.）に投与した場合の生体分布と毒性はどのようなものでしょうか？
最近のレビューにまとめられているように、生体内でのGOの効果に関する研究は一貫性がないと報告されています。
Zhangらの初期の研究では、マウスにi.v.注射したGOの分布と生体適合性を調べました。静脈注射後48時間以内に、GOは血流から除去され、様々な臓器に分布し、肺、肝臓、脾臓に好んで蓄積されます。低用量(1 mg kg-1)では14日後に病理学的変化が見られないことが報告されていますが、高用量(10 mg kg-1)では、肺全体に肉芽腫性病変、肺水腫、炎症細胞の浸潤、線維化が観察されました99。多くの研究により、生体内におけるGOの蓄積と毒性の主要な部位は肺であることが確認されました。肺に直接注入した場合、GOは重度の長期（21日間）肺障害を引き起こすが、グラフェンフレークは分散状態でも凝集状態でも、肺マクロファージのアポトーシスを増加させない100。Zhangの報告では、GOの大きさは10～800 nmであり、これが特徴的なクリアランス挙動を引き起こした。サイズの小さい粒子は注射後12時間以内に腎経路で速やかに排出されたが、サイズの大きい粒子は肺で遮断された99。Liuは、小粒のGOフレーク(s-GO、平均流体力学的直径約250 nm)と大粒のGOフレーク(l-GO、平均流体力学的直径約900 nm)の2種類のGOを単回高用量(2.1 mg kg-1)または7回の反復低用量(0.3 mg kg-1)で静脈内投与しました。サイズに関係なく、GOの単回高用量投与は肺の損傷と炎症細胞の浸潤を引き起こしました。肺では、GOはマクロファージに蓄積されたが、リンパ球には蓄積されなかった。リンパ球はリクルートされたが、GOを捕捉することはできなかった。この研究で著者らは、in vitroでGOにさらされた細胞では酸化ストレスが広く存在する現象であるが、生体内ではGOの周りにBCを形成するタンパク質の保護効果を考慮すべきであると主張した。
複数回の投与では、サイズに依存した興味深い結果が報告された。s-GOは糸球体から速やかに排出されるため、腎障害を引き起こしたり、腎臓に蓄積したりすることはなかった。逆に、l-GOは腎臓から排出されず、障害を引き起こした。肺は、l-GOを複数回投与した場合にのみ損傷を受けた。この効果は、肺の中で大きなGO複合体のブロックを誘発するタンパク質とGOの凝集による。この仮説は、l-GOとタンパク質の複数の複合体が形成されて毛細血管に入り、複数の損傷点と炎症細胞の動員を引き起こすことに依拠している。一方、s-GOは、低用量投与のたびに肺の毛細血管を通過することができた。l-GOでは腎臓と肺がより損傷を受けたが、s-GOは肝臓に優先的に蓄積し、毒性を発揮した。
高濃度の単回投与では、s-GOはl-GOタンパク質複合体と同程度の大きさに達する大きな複合体を形成するため、肺にもダメージを与える可能性があります44。
もし、ワクチンに使用されているナノ粒子のサイズがs-GOか、ｌ-GOかで上記のような症状に繋がるという事です。
そういえば、昨年新型コロナが最初に出た時、Ｌ型、Ｓ型とか言っていませんでしたっけ？
それらの区別が上記と症状がイコールだったりしませんかね。。。。
要約すると、s-GOはl-GOよりも安全性が高いが、単回高用量では血液タンパク質、ひいてはBCとの凝集により、毒性のある大型複合体の形成が誘発されるということである。これらの結果は、Tween-80界面活性剤の添加によりGO (30-1000 nm)の凝集が抑制されたQuらの研究と一致しています。101 GOが凝集して肺のマクロファージに蓄積したのに対し、Tween-80 GOはより安定しており、Kuppfer細胞（マクロファージ）内の肝臓に蓄積しました。101 興味深いことに、rGOはin vivoでの血栓原性が低下し、生体適合性と脳組織のターゲティングが改善されているようです。rGO（横方向のサイズが342nmのものを7mgkg-1で単回投与）を静脈内に投与したところ、血液、肝臓、腎臓に軽微な毒性の兆候が見られ、7日後には炎症が見られなくなった。
BCの吸着は、ナノ粒子の生体内分布に影響を与える重要な因子であることが知られている。BCは2つの方法で作用する。(i)貪食細胞の摂取を促進/回避し、循環時間に影響を与える、(ii)ナノ材料のサイズを調節する、というものである。サイズは分布を調整し、毛細血管よりも小さいサイズの粒子は主に肝臓、脾臓、骨髄で貪食され、逆に大きな粒子は肺に閉じ込められます44。
したがってGOは、他のナノ材料と同様に粒度分布のルールに従っている。しかし、BCは、血流中の免疫細胞（単球、血小板、白血球、樹状細胞）と、組織内の常在食細胞（肝臓のクッパー細胞、リンパ節のDC、脾臓のマクロファージとB細胞など）による取り込みにも影響を与えます。逆に、マクロファージの取り込みは、粒子径を約150nmに維持し、オプソニン相互作用59,98や非特異的なタンパク質吸着を低減する親水性分子やアルブミンをナノ材料に付与することで低減することができる103。
ナノマテリアルの表面にPEGなどのポリマーコーティングを加えることは、免疫細胞による認識を回避するためのツールとなる。PEGは、粒子の血中循環を長くし、脾臓や肝臓に存在する食細胞による取り込みを著しく減少させることが知られている。これは、PEGがコーティングされた粒子の周りに立体的なシールドを作り、血漿タンパク質が粒子表面に付着するのを効果的に防ぎ、その結果、単核食細胞によるその後の取り込みを回避しているのではないかという仮説が立てられている。PEG化したGOシート（10～30 nm）は、主に肝臓と脾臓に分布し、90日以内の高用量（20 mg kg-1）では毒性を示さなかったと報告されている74,104。これは、サイズが小さいことと、PEG化によってナノ材料が安定化し、凝集が防止されるとともにBCの形成が抑制されることの両方に起因すると考えられる。
Luoらは、GOのPEG化がマクロファージの活性化を妨げないことを示した105。nGO-PEGは、横方向のサイズが約200 nmの機能化GOであり、マクロファージの取り込みを妨げるが、マクロファージの細胞膜と物理的に接触することでサイトカインの放出を促進し、下流でさらなる免疫反応を引き起こす可能性がある。
PEG化と同様に、デキストランコーティングは、ナノ材料へのタンパク質の吸着を低減し、生体適合性を向上させるためのよく知られた戦略である106,107。共有結合のプロトコルで得られたデキストラン-GOは、血液からの迅速なクリアランス、肝臓と脾臓への蓄積、1週間後のマウスの体内からの排除を示した106。
セクション3で見てきたように、GOの表面機能化は、そのタンパク質コロナを修飾することができます。GO-PAAは、GO-、GO-NH2、GO-PAM、GO-PEGで処理したマウスと比較して、肝臓と肺の臓器障害を軽減することができました56。
最後に、注入したGOの分解はバイオセーフティ上の重要な懸念事項です。GO と血漿との長期的な相互作用 (14 日間) により、ヒドロキシルラジカルの作用でホールが形成され、還元および生分解が起こります54。免疫細胞に取り込まれると、生分解性の粒子は消化されて体外に排出されますが、非生分解性の粒子は長期間にわたって細胞内に蓄積されます。
最近の研究では、好中球のミエロペルオキシダーゼ(MPO)による大型GO(10μm)と小型GO(100nm)の分解を調査しました108。どちらの種類のGOシートも、脱顆粒後の好中球だけでなく、リコンビナントヒトMPOによっても12時間以内に分解されました。さらに、反応生成物は、ヒト気管支上皮細胞株を用いて毒性試験を行い、安全性が確認された。しかし、MPOの分解は、GOの安定性に大きく依存しており、凝集したGOシートは分解を受けないようである。109 生体内でのカルボキシル化グラフェンの分解には、主にマクロファージが関与しているという報告もある110。
PEG化はGOの毒性を低下させますが、GOの分解を妨げる可能性があります。PEGまたはBSAでコーティングしたGO/rGOは、いずれも酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）消化に耐性がある。同じ研究で、Liらは、切断可能なジスルフィド結合を介してGOにPEGを結合させ（GO-SS-PEG）、ナノ粒子の分解性を向上させた。ナノ粒子は、指定された組織に到達した後、細胞の細胞質内のグルタチオン／食細胞のファゴソーム内のミエロペルオキシダーゼによってジスルフィド結合が切断される可能性がある74。
科学的には大きな進歩を遂げたが、生体内での応用を目指した今後の研究では、グラフェン研究のいくつかの弱点に注目すべきである。第一に、グラフェン材料は、迅速な排泄を可能にする安定した小型サイズや、毒性を抑えるための分解性のある組成を持つだけでなく、それ以上のものを設計する必要がある。グラフェンの薬理学的投与を目的とした論文では、サイズ、表面積、電荷、純度、酸素含有量、体液中での安定性、BCの組成など、詳細な物理化学的特性を記載する必要がある。
2017年、Reinaらは、科学的成果の臨床への移行を促進するために、グラフェン材料の毒性をより明確に把握するためのガイドラインを定義した111。これらのガイドラインは、以下のように要約できる。
- 確立された材料名を使用する。
- 物理化学的特性（C/O比、表面改質／機能化、金属痕、サイズ、層数、表面積、表面電荷など）および製造情報を提供する。
- 推奨される処理方法の使用
- 生体適合性試験、細胞毒性、遺伝毒性、生分解性、臓器への分布・蓄積、代謝を行う。
FBSが存在すると細胞培養液中でBCが形成され、これがin vitroの結果に影響を与える。このことと、グラフェンの特異な光学特性が、細胞代謝のためのMTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法などの標準的な生物学的測定法に影響を与える可能性があり、GOをin vitroで試験する際には考慮する必要がある。また、GOはタンパク質との結合性が高いため、生物学的測定に使用される試薬の一部を阻害する可能性があります8。
7. おわりに
この10年間で、注入可能なナノ粒子の設計は、生体内の細胞と組織の接点であるBC形成の制御に影響を与えてきた。このレビューで紹介したすべての実験結果をまとめると、BCはGOのいくつかの相互作用に大きく影響すると結論づけることができます。BCは、GOの溶血作用を抑制し、補体の活性化を制御し、免疫応答活性と生体内分布を媒介する。
生体内でのタンパク質との相互作用を正確に制御することは困難であるため、BCを調節するために考案された戦略のほとんどは、タンパク質の吸着を抑制する抗ファウリングポリマー残基での機能化に基づいており、完全にターゲティング効率を低下させている43。GOの場合、非特異的なタンパク質の吸着を低減するためのキトサンによるプレコーティング、体内からの排除を向上させるためのデキストランやPEGによる機能化、アミノ化やカルボキシル化による表面官能基の修飾などがBCを調節するためのアプローチの例である。
ナノマテリアルのBCの特性は、特定のセルターゲティングアプリケーションに有用であることが想像できる。GOとrGOのBC組成は研究され始めたばかりだが、最初のデータは心強いものだった。例えば、グラフェンコロナのApoE残基の濃縮は、血液脳関門を越えて脳血管内皮を標的とした神経疾患の治療に有用である113。GOの補体活性化は、皮下や皮内など他の経路で投与されたワクチンの抗原提示の強化に利用できる8。
さらに、GO-BCは、糖尿病などの疾患を持つ患者の血漿中に浸漬するとユニークな特徴を示し、BCに基づいた診断法の開発に利用できる可能性があります52,115。もう1つの重要な未解決問題は、スカフォールドを患者に移植する際のBC組成のばらつきを考慮すると、コロナがグラフェンベースの生体工学的固体インプラントの生体適合性にどのような影響を与えるかということである116。
GO研究の大きな進歩に基づき、ナノメディカル応用の新たな機会が得られることを予見することができる。このレビューで紹介された議論が、研究者が臨床応用に向けてGOの限界を押し広げるための一助となることを願っています。
きっと、「グラフェンコロナのApoE残基の濃縮は、血液脳関門を越えて脳血管内皮を標的とした神経疾患の治療に有用である」とあるように、この酸化グラフェンやそれを使用したワクチンを開発してきた人たちは、これによって、あらゆる病気が出来ない環境を構築しようと思って開発に携わっていたのかもしれません。
しかし、実際は違う使われ方をしてしまった。。。
そう感じました。
文字数オーバーのため、次回に続きます。