ニンテンドーWi-Fiコネクションの実装によりインターネット接続を用いて世界中のプレイヤーと対戦が行える。Wi-Fiコネクション対応の作品としては日本では2作目、世界全体では初の作品がマリオカートだ。
コースは新作から過去シリーズのものまでが登場し、数は左右反転コースを別々に数えれば64・GBA版に次いで多い。
また、新たなモードとして「ミッションラン」が登場。
マップ表示は、従来のコース全体を大まかに写すものではなく、DSの下画面全体を使ったより詳細なものに変わった(コース全体表示に切り替えることもできる)。
そのため、後方の相手にアイテム攻撃が命中しやすくなっている。マリオGPモードではランク別評価が再登場。敵の攻撃頻度も上がり、特にプレイヤーを直接狙った攻撃が多い。
これまで、プレイヤー同士しか遊べなかったVSモードとバトルモードがCOM相手に1人でもプレイ可能となり、対戦人数の上限もこれまでの4人から8人へと増加した。
より新しく、難易度の上限もあがった国民的ゲーム マリオカート
ゲームモードもよりいっそう楽しく増えました
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ゲームモード 
グランプリ
- 4コースをひとまとめにした大会(カップ)を選択して、順位に応じたポイントを得て、総合得点を競うモード。カップは全部で8種類。
- 排気量は50cc、100cc、150ccの3種類から選べる。排気量が上がるほどスピードが増すし、COMの攻撃を激しくなって難易度も上がる。
- 特定の条件を満たすことで、150ccミラーという新たなクラスが出現する(スピードは150ccと同じだが、コースが左右反転する)。
- タイムアタック
- 選択したコースでタイムを競う。ベストラップタイムと上位5つまでの総合タイムを記録可能。今回は、カートのアイテム性能によって所持しているキノコの個数が1 - 3個に決められている。
- コースごとに決められたタイム以上でゴールすると、スタッフのゴーストが出現する。ワイヤレス通信を使用することで他のプレイヤーのゴーストをもらうこともできる。
- VS
- 選択したコースで順位を競う。赤チームと青チームに分かれたチーム戦も可能。
- バトル
- これまでの“ふうせんバトル”に加え、新ルール“あつめてシャイン”が登場。通信対戦も実装されている。チーム戦あり。
- ミッションラン
- 時間内に、与えられた課題をクリアするモード。クリアできればランクが表示される。レベルは1 - 7までで、それぞれ8ステージ+ボスキャラとの戦いで構成され、クリアすると次のレベルをプレイ可能になる。
- 但し、最も難しいレベル7に進むにはそれ以外の条件も必要になる。
キャラクター 
今作では各キャラに3台ずつ性能の異なるカートが用意されている。
カートは全シリーズ中最多の36台(ヘイホーを入れると37台)。
条件を達成すると、自分だけの組み合わせができるようになり、自分だけのカートが作れるようになる。
今回では性能に「アイテム」が登場した。
これの性能が高ければ高いほど、スペシャルアイテム(トリプルバナナ・トリプルこうら・スター・キラー・ゲッソー・テレサ)が出現しやすくなる他、タイムアタック開始時に持っているキノコの数が増えるが、カートが重くなり基本性能が下がる。
逆に低ければ低いほどスペシャルアイテムの出現しにくくなる(逆に言えば、スペシャルアイテムでないトゲゾーこうら・サンダーが出やすい)他、タイムアタック開始時に持っているキノコの数が減るが、カートが軽くなり基本性能が上がる。
なお、キャラはバランスタイプ・ドリフトタイプ・グリップタイプの何らかに属している。また、キャラごとに用意された3台のカートは後者ほど軽量である。
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